米諾環素對大鼠腦出血后VEGF、GLUT-1表達的影響

陳建新

摘要：目的 ?研究米諾環素對腦出血大鼠VEGF、GLUT-1表達的影響，探討其的腦保護作用機制。方法 ?選用雄性Wistar大鼠60只，隨機分為假手術組、模型組及米諾環素組，每組20只。采用Ⅶ型膠原酶法制備Wistar大鼠右側紋狀體出血模型。模型制備成功后米諾環素組給予腹腔注射米諾環素，劑量為22.5 mg/kg，2次/d，假手術組和模型組給予腹腔注射等量的生理鹽水。觀察腦缺血后改良神經功能缺損評分（mNSS）、腦組織含水量，Western blots及免疫組化法分別檢測VEGF及GLUT-1的表達。結果 與模型組相比，米諾環素組大鼠腦組織的mNSS評分、腦組織含水量、VEGF及GLUT-1的表達量降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 ?米諾環素可顯著減輕腦出血后大鼠的神經功能損害及組織學損傷，并提高大鼠腦組織VEGF及GLUT-1的表達水平，對腦出血具有一定的神經保護作用，其機制可能與增強VEGF及GLUT-1的表達有關。

關鍵詞：腦出血;米諾環素;VEGF;GLUT-1

中圖分類號：R743.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.026

文章編號：1006-1959（2019）21-0085-03

Abstract：Objective ?To investigate the effects of minocycline （MC） on the expression of VEGF and GLUT-1 in rats with intracerebral hemorrhage， and to explore the mechanism of brain protection of minocycline. Methods ?60 male Wistar rats were randomly divided into sham operation group， model group and minocycline group， with 20 rats in each group. The right striatum hemorrhage model of Wistar rats was prepared by type VII collagenase method. After successful model preparation， the minocycline group was given intraperitoneal injection of minocycline at a dose of 22.5 mg/kg twice daily. The sham operation group and the model group were given an equal amount of normal saline. The cerebral ischemic modified neurological deficit score （mNSS）， brain tissue water content， Western blots and immunohistochemistry were used to detect the expression of VEGF and GLUT-1.Results ?Compared with the model group， the mNSS score， brain water content， VEGF and GLUT-1 expression in the brain tissue of the minocycline group were significantly lower （P<0.05）.Conclusion ?Minocycline can significantly reduce the neurological damage and histological damage in rats after intracerebral hemorrhage， and increase the expression of VEGF and GLUT-1 in rat brain tissue. It has a certain neuroprotective effect on intracerebral hemorrhage， and its mechanism may be associated with enhanced expression of VEGF and GLUT-1.

Key words：Intracerebral hemorrhage;Minocycline;VEGF;GLUT-1

腦出血（intracerebral hemorrhage，INH）是常見的卒中類型，具有較高的致殘率及致死率，嚴重威脅患者生命健康及生活質量，給社會及家庭帶來了沉重的經濟負擔。目前仍缺乏有效的藥物改善預后，因此探討腦出血的病因并尋找針對性的有效藥物是亟待解決的問題[1]。近年來亦有研究表明米諾環素（MC）對神經系統具有一定的保護作用[2]。血管內皮生長因子（VEGF）是體內一種具有神經營養及神經再生作用的因子，可促進內皮細胞增生，加速組織修復。葡萄糖轉運體（GLUT）可維持機體的能量代謝，并參與機體的多種神經生理過程，從而對腦組織發揮保護作用，而發揮主要作用的是GLUT-1[3]。本研究利用大鼠腦出血模型，檢測MC對腦出血大鼠腦組織VEGF及GLUT-1表達的影響，探討MC對腦出血的潛在神經保護作用機制。

1材料和方法

1.1實驗動物的分組和處理 ?健康SPF級雄性Wistar大鼠60只，8周齡，體重約250～300 g，由山東大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法將其分為假手術組、模型組及米諾環素組，每組20只。

1.2方法

1.2.1腦出血動物模型的建立 ?采用Ⅶ型膠原酶法制備Wistar大鼠腦出血模型。具體操作如下：以8周齡雄性Wistar大鼠前囟為原點，在大鼠前囟右側3.2 mm、前方0.5 mm處，以微型電鉆（Roboz，RS-6300，美國）鉆孔，將微量注射器固定于相應位置緩緩插入，深度5.6 mm，米諾環素組和模型組大鼠以微量注射器（Hamilton，80565，美國）向其右側紋狀體緩慢注射經無菌生理鹽水（廣西裕源藥業有限公司，批號：H45020977，規格：500 ml/瓶）稀釋的Ⅶ型膠原酶（江萊生物<上海>，93703879）2 μl，假手術組大鼠注射等體積生理鹽水，停針3 min使溶液充分擴散后拔針、仔細縫合手術傷口。術后米諾環素組予腹腔米諾環素注射液（湖北潛龍藥業股份公司，批號：20050602，規格：50mg）22.5 mg/kg，2次/d，假手術組和模型組給予腹腔注射等量生理鹽水，共28 d。

1.2.2神經功能評價 ?分別于治療后第1、3、7、14、28天使用改良mNSS評分評價大鼠神經功能。包括運動實驗（6分）、感覺實驗（2分）、平衡木實驗（6分）、反射實驗和不正常運動（4 分），總評分共18 分，其中評分7分以下為輕度損害、評分7～12分中度損害、評分12分以上重度損害。

1.2.3腦組織含水量測定 ?采用干濕重法測定腦組織含水量。治療結束后每組每個時間點（第1、3、7、14、28天）分別隨機選取3只大鼠，以10% 水合氯醛（300 mg/kg）（Macklin， MFCD00044479，美國）麻醉大鼠，端頭取腦，稱重缺血側的腦組織，后將其放入100 ℃的烤箱（中杰，ZJ885-6型，蘇州）中烤至恒重，當2次稱重腦組織質量差小于0.2 mg時，記錄最后1次質量為腦組織的干重。計算腦組織的含水量，腦組織含水量（%）=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%。

1.2.4大鼠腦組織灌注取材 ?治療結束后，各組剩余5只大鼠予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪刀剪開劍突下皮膚，充分暴露心臟，以大號注射針頭刺入尖部，經左心室入主動脈，剪開右心耳。以生理鹽水約100 ml 快速灌注，繼之300 ml 生理鹽水緩慢灌注，于冰上斷頭取腦，額極后2.5 mm 處切取3.0 mm 厚的腦組織，每只大鼠的一半腦組織放入4%多聚甲醛液中浸泡30 min 后進行聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（OCT）包埋，另一半腦組織經液氮速凍后于-80 ℃保存，提取蛋白后行Western blots檢測。

1.2.5 Western blots檢測VEGF表達水平 ?取凍存腦組織，加入組織蛋白質抽提液，勻漿器高速勻漿，4℃冰凍離心機以12000 r/min離心15 min，收集上清液，采用BCA試劑盒（百奧萊博，HR-0359-BKL，北京）檢測總蛋白濃度，根據蛋白濃度配膠上樣，每孔20 μg 蛋白，經電泳、轉膜后，以5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃下VEGF（BioXcell，BE0060-100MG）一抗孵育過夜，洗膜后二抗孵育，化學發光法掃膜分析，以β-actin （TIANDZ，130590-20，中國）作為內參。

1.2.6免疫熒光染色檢測GLUT-1的表達 ?OCT包埋腦組織后，行冰凍切片切片以磷酸鹽緩沖溶液沖洗3 次，10 ml/dl 山羊血清封閉，PBS 沖洗，室溫孵育GLUT-1（Santacruze，sc-377228，美國）一抗2 h，后二抗孵育1 h，孵育完成后，切片滴加抗淬滅溶液后加蓋玻片保存，于共聚焦顯微鏡（Nikon，尼康A1型，日本）下觀察，采集圖片分析。

1.3統計學方法 ?采用SPSS 20.0 軟件分析，計數資料用（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠mNSS評分比較 ? 與假手術組的大鼠比較，模型組及米諾環素組大鼠在造模后的第1、3、7、14、28天時mNSS評分均較假手術組升高（P<0.05）;與模型組的大鼠比較，米諾環素組的大鼠的mNSS評分明顯降低（P<0.05），見表1。

2.2各組大鼠腦含水量的比較 ?與假手術組的大鼠比較，模型組及米諾環素組的大鼠在造模后第1、3、7、14、28天時大鼠腦含水量升高（P<0.05）。與模型組的大鼠比較，米諾環素組的大鼠的腦含水量降低，（P<0.05），見表2。

2.3各組大鼠腦VEGF及GLUT-1表達水平的比較 ?假手術組、模型組及米諾環素組GLUT-1的熒光強度分別為（68.76±5.47）、（35.85±3.39）及（46.82±4.25）;與假手術組的大鼠比較，模型組及米諾環素組的大鼠在造模后GLUT-1表達水平降低（P<0.05）。與模型組的大鼠比較，米諾環素組的大鼠的GLUT-1表達水平升高（P<0.05），見圖1、圖2;假手術組、模型組及米諾環素組VEGF的表達量分別為（78.32±6.21）、（39.52±4.63）及（58.37±5.03）。與假手術組的大鼠比較，模型組及米諾環素組的大鼠在造模后VEGF表達水平降低（P<0.05）;與模型組的大鼠比較，米諾環素組的大鼠的VEGF表達水平升高（P<0.05），見圖3、圖4。

3討論

腦出血是臨床常見的腦血管病之一，常見于中老年人，其發病率高、致殘率高且死亡率高，給社會及家庭帶來較沉重的負擔。目前腦出血缺乏有效的治療藥物，因此闡明腦出血的發病機制并探尋有效的藥物是目前臨床腦出血防治亟待解決的重大課題。