PPZ與5-FU對胃癌細胞生長、自我更新能力的影響及相互作用

馮水土 馮麗華 任芳

摘要：目的 ?探討泮托拉唑（PPZ）、5-氟尿嘧啶（5-FU）在調控胃癌細胞及胃癌干細胞生長、自我更新能力中的影響及其相互作用。方法 ?將SGC-7901和HGC-27細胞分為3組實驗：5-Fu處理組、PPZ處理組和5-Fu+PPZ組。通過細胞成球實驗檢測PPZ加藥前后胃癌細胞系（SGC7901、HGC-27）中胃癌細胞及胃癌干細胞自我更新能力的變化，觀察PPZ對胃癌細胞系成球能力干擾情況;MTT法檢測PPZ、5-FU對胃癌細胞及胃癌干細胞增殖能力的影響，觀察PPZ對5-FU藥物敏感性的調節作用。結果 ?PPZ加入后胃癌細胞系（SGC7901、HGC-27）和胃癌干細胞系（SGC7901-SP、 HGC-27-SP）自我更新率比PPZ加入前的自我更新率下降（P<0.01）;PPZ、5-FU對胃癌細胞（SGC7901、HGC-27）增殖均有抑制作用，而5-Fu+PPZ聯合組抑制最為明顯，抑制增殖的作用在24 h開始出現，96 h最低，均低于0 h。PPZ對胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）增殖均有抑制作用，在48 h逐漸明顯;加入PPZ后，胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）兩個細胞系酶標儀檢測到的吸光值在48 h、72 h、96 h時均下降。72 h和96 h時，加與不加PPZ的吸光值比較，統計學意義顯著（P<0.01）。不同濃度（0～50 μg/ml）5-FU對胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）增殖抑制的差異不顯著;而加入PPZ 100 μg/ml后，隨著5-FU濃度的增加增殖抑制作用逐漸增強，在40～50 μg/ml濃度的5-FU對胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）增殖抑制更加明顯;加入PPZ 后，40 μg/ml及50 μg/ml濃度的5-FU作用下胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）酶標儀檢測到的吸光值均降低。結論 ?PPZ能有效抑制胃癌細胞及胃癌干細胞的自我更新能力，抑制其增殖，并可提高其對5-FU的化療敏感性。PPZ有望成為逆轉胃癌耐藥的一類聯合治療藥物應用于臨床。

關鍵詞：胃癌;PPIs;5-FU;腫瘤成球能力;自我更新

中圖分類號：R735.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.020

文章編號：1006-1959（2019）21-0061-05

Abstract：Objective ?To investigate the effects of pantoprazole （PPZ） and 5-fluorouracil （5-FU） on the growth and self-renewal of gastric cancer cells and gastric cancer stem cells. Methods SGC-7901 and HGC-27 cells were divided into three groups of experiments： 5-Fu treatment group， PPZ treatment group and 5-Fu combined with PPZ treatment group. The changes of self-renewal ability of gastric cancer cells and gastric cancer stem cells in gastric cancer cell lines （SGC7901， HGC-27） before and after PPZ dosing were detected by cell globule assay. The interference of PPZ on the ability of gastric cancer cell line to form a ball was observed. MTT assay for PPZ， 5-FU effect on the proliferation of gastric cancer cells and gastric cancer stem cells， and to observe the regulation of PPZ on its 5-FU drug sensitivity.Results ?The self-renewal rate of gastric cancer cell lines （SGC7901， HGC-27） and gastric cancer stem cell lines （SGC7901-SP， HGC-27-SP） after PPZ addition was lower than that before PPZ（P<0.01）. PPZ and 5-FU inhibited the proliferation of gastric cancer cells （SGC7901， HGC-27）， while the 5-Fu+PPZ combination showed the most obvious inhibition. The inhibition of proliferation began to appear at 24 h， the lowest at 96 h，Both are below 0 h. PPZ inhibited the proliferation of gastric cancer stem cells （SGC7901-SP， HGC-27-SP）， and became obvious at 48 h. After adding PPZ， two cell lines of gastric cancer stem cells （SGC7901-SP， HGC-27-SP） were labeled. The absorbance values detected by the instrument decreased at 48 h， 72 h， and 96 h. At 72 h and 96 h， the absorbance values of the plus and without PPZ were statistically significant （P<0.01）. Different concentrations （0～50 μg/ml） of 5-FU had no significant difference in the inhibition of proliferation of gastric cancer stem cells （SGC7901-SP， HGC-27-SP）， but increased with the concentration of 5-FU after adding PPZ 100μg/ml. The inhibition of proliferation was gradually enhanced， and the proliferation of gastric cancer stem cells （SGC7901-SP， HGC-27-SP） was more obvious in 5-FU （40～50 μg/ml） concentration; 40 μg/ml and 50 μg were added after adding PPZ. At the concentration of 5-FU， the absorbance values of gastric cancer stem cells （SGC7901-SP， HGC-27-SP） were decreased.Conclusion ?PPZ can effectively inhibit the self-renewal ability of gastric cancer cells and gastric cancer stem cells， inhibit their proliferation， and improve their chemosensitivity to 5-FU. PPZ is expected to be a combination of a combination of therapeutic drugs for reversing gastric cancer.

Key words：Gastric cancer;PPIs;5-FU;Tumor globular ability;Self-renewal

胃癌（gastric cancer）是常見的惡性消化系統腫瘤，雖然在全世界范圍內發病率有所下降，但仍是癌癥死亡的第3大原因[1]。晚期胃癌治療手段及效果有限，在我國年死亡率占惡性腫瘤第2位[2]，5年生存率20%～30%[3，4]。僅有包括5-FU、多柔比星、順鉑等數種化療藥物對胃癌有一定療效，由于藥物抗性的發生，治療有效率僅為15%～50%[5，6]。如何降低化療耐藥一直是臨床醫生關注的問題。研究已證明胃癌細胞上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）形成的胃癌干細胞（gastric cancer stem cells，GCSCs） 是其化療抵抗及形成腹腔轉移的重要驅動者[7-10]。研究表明[11-15]，活體當中的胃癌細胞往往處在一個酸性的缺氧微環境中，這有利于癌細胞的增殖、侵襲、抵抗化療藥物等。胃癌細胞內質子外排是腫瘤細胞提升自身在酸性環境下生存力的有力手段[16，17]。通過抑制細胞內質子外排可能是逆轉胃癌化療耐藥的方法之一。因而，本研究通過使用質子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPIs）泮托拉唑（pantoprazole，PPZ）來干擾胃癌細胞株及其胃癌干細胞（GCSCs）株的成球能力和增殖能力，探討PPIs對胃癌細胞株及其胃癌干細胞株自我更新能力的影響。

1材料與方法

1.1主要實驗儀器及耗材 ?CO2細胞培養箱購自Thermo Scientific，生物安全柜購自Heal Force，倒置顯微鏡購自Motic，低速離心機購自長沙鑫奧，100 mm細胞培養板、96孔超低吸附細胞培養板和6孔超低吸附細胞培養板購于Corning，流式細胞儀購自Beckman CouLter公司，酶標儀購自Thermo。

1.2主要實驗試劑 ?1640培養基和DMEM/F12培養基購自Hyclone，胎牛血清、B27、EGF和FGF購自GIBCO，青鏈霉素購自MP，胰酶消化液購自Auragene，Insulin和BSA購自索萊寶，Hoechst3342、PI、維拉帕米購自Sigma，MTT 購自上海生工。

1.3干細胞成球培養基（SFM）的配制 ?母液配置濃度為：EGF 100 ng/ml、FGF 100 ng/ml、BSA 20%、Insulin 1 mg/ml，將DMEM-F12倒入干凈的50 ml血清瓶中，分別加入1 ml 50xB27、50xL-Gln、EGF 10 μl、FGF ?10 μl、20%濃度的BSA 1 ml、insulin 20μl、Pen/strep 0.5 ml，配制干細胞培養基（濃度為：DMEM/F12 1×、B27 1×、EGF 20 ng/ml、FGF 20 ng/ml、BSA 0.4 %、Insulin 4 μg/ml、L-Gln 1×、Pen/strep 100 U/ml）。

1.4流式側群分選獲取胃癌干細胞 ?在37℃、5% CO2飽和濕度條件下用完全培養液（1640含10%小牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素）培養胃癌細胞（SGC7901、HGC-27），每周換液2～3次，細胞生長至80%后使用0.25%胰蛋白酶消化并傳代、計數，用培養基（DMEM/F 12）重懸至1×106 /ml的濃度，分成3組2管，分別用37℃ DMEM/F12洗滌，制成細胞懸液;其中兩組均加入熒光染料Hoechst33342，使終濃度為5 μg/ml。另一組作為對照，加維拉帕米 （終濃度50 μmol/L）;室溫37℃，避光條件下水浴 ?90 min后在冰上冷卻10 min來終止染色并進行細胞計數;離心后用冰預冷的DMEM/F12洗滌細胞重懸浮，濃度調整至超過1×105/ml;加入PI使終濃度為2 μg/ml后上機。用細胞流式細胞儀（400濾網過濾）檢測，分選出干細胞（SP）及非干細胞（NSP）。DMEM/F12收集分選后細胞，流式細胞儀再分析細胞純度。確定SP 與NSP細胞純度達80%以上。

1.5細胞成球實驗 ?分別收集胃癌細胞和胃癌干細胞單細胞懸液，接種到超低吸附培養板中，每孔用 ?2 ml干細胞條件培養基進行培養，將6孔的細胞數調整成一定的梯度（1000個、5000個、10000個、10000個、20000個、20000個）。每天拍照觀察腫瘤細胞球生長情況，隔天再加入1 ml培養基，確定最佳培養密度。在細胞培養板中以4×105 個/ml的細胞密度接種，加入2 ml配好的干細胞培養基，在細胞培養箱（37℃、5% CO2）中培養48 h后再收集細胞，用0.05% 的胰酶消化5～10 min后再加1 ml干細胞培養基終止消化，均勻吹打后吸取10 μl的懸液對細胞進行計數，以相同的密度重新接種到另一的超低吸附6孔培養板中。

1.6腫瘤（干）細胞自我更新實驗 ?分別收集胃癌細胞和各組成球細胞，用0.05 %的胰酶消化液消化后在成球培養基中制成單細胞懸液（濃度至1×103 個/ml）備用;取6塊96孔超低吸附板（胃癌細胞與胃癌干細胞各3板），每個細胞共180 孔（96 孔板邊緣孔加200 μl PBS），取1 μl加入到96 孔超低吸附板（每孔含200 μl干細胞培養基）;顯微鏡下觀察，將多于1個或不含細胞的孔標記排除;每天顯微鏡下觀察，大約6～10 d，記錄形成腫瘤個數和大小。結果計算：自我更新率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.7 MTT檢測PPZ和5-FU對胃癌（干）細胞生長的影響

1.7.1 MTT檢測PPZ和5-FU對胃癌細胞生長的影響 ?為確定PPZ是否具有協同5-Fu抑制細胞增殖作用，將SGC-7901和HGC-27細胞分為3組實驗：5-Fu處理組、PPZ處理組和5-Fu+PPZ組。在5塊96孔板上每孔各加入100 μl制備好的的胃癌細胞（SGC7901、HGC-27）懸液，鋪板使待測細胞數量達5×103 個/孔，每組設置5個復孔;在37℃條件下5% CO2培養箱繼續培養24 h后取出進行檢測。在3塊96孔板加藥，PPZ處理組加入100 μg/ml PPZ、5-Fu處理組加入20 μg/ml 5-FU、5-Fu+PPZ組同時加入同劑量兩種藥物。檢測時每孔加MTT溶液10 μl，繼續培養4 h;用酶標儀檢測各孔波長570 nm的吸光值，每隔24 h取出一塊96孔板行檢測。

1.7.2 MTT檢測PPZ和5-FU對胃癌干細胞生長的影響 ?胃癌細胞（SGC7901、HGC-27）經四代成球分選后得到的干細胞株（SGC7901-SP、HGC-27-SP）在成球培養條件下，加入100 μg/ml PPZ，通過MTT檢測其對胃癌干細胞生長的影響：在5塊96孔板上每孔各加入100 μl制備好的的胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）懸液，鋪板使待測細胞數量達5×103 個/孔，每組設置5個復孔;在37℃條件下5% CO2培養箱繼續培養24 h后取出進行檢測。在4塊96孔板加藥，共設置兩個分組：一組加入100 μg/ml PPZ;另一組不添加藥物。檢測時每孔加入MTT溶液10 μl，繼續培養4 h;用酶標儀檢測各孔的波長570 nm的吸光值。之后每隔24 h取出一塊96孔板進行檢測。

胃癌細胞（SGC7901、HGC-27）經四代成球分選后得到的干細胞株（SGC7901-SP、HGC-27-SP）在成球培養條件下，加入100 μg/ml PPZ，通過MTT檢測各組胃癌干細胞對5-FU的藥物敏感性：在2塊96孔板上每孔各加100 μl制備好的的胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）懸液，鋪板使待測細胞數量達5×103 個/孔，每組設5個復孔;在37℃條件下5% CO2培養箱繼續培養24 h后取出96孔板加藥，其中一塊加100 μg/ml PPZ，另一塊不加PPZ。兩塊板均加不同濃度梯度（0～50 μg/ml）的5-FU，24 h后取出行檢測，檢測時每孔加MTT溶液10 μl，繼續細胞培養箱培養4 h;用酶標儀檢測各孔波長 ? ? 570 nm的吸光值。

1.8統計學方法 ?采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，兩組數據采用兩樣本獨立t 檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義，P<0.01表示統計學意義顯著。

2結果

2.1 PPZ抑制胃癌（干）細胞成球能力 ?在細胞培養皿中PPZ加入前后兩種胃癌細胞系（SGC7901、HGC-27）的成球數和自我更新率均下降，統計學意義顯著（P<0.01），見表1。在胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）的實驗中，加入PPZ后腫瘤球形成數及自我更新率均下降，統計學意義顯著（P<0.01），見表2。

2.2 MTT檢測PPZ和5-FU對胃癌細胞生長的影響 ?PPZ、5-FU對胃癌細胞（SGC7901、HGC-27）增殖均有抑制作用，而5-Fu+PPZ聯合組抑制最為明顯;PPZ組胃癌細胞（SGC7901、HGC-27）兩個細胞系酶標儀檢測到的吸光值在48 h時開始出現下降，直到96 h時仍低于0 h;5-FU組在24 h時開始出現下降直到96 h時，最低為96 h，均低于0 h;5-Fu+PPZ聯合組抑制增殖的作用亦是24 h開始出現，96 h最低，均低于0 h，見表3、表4。

2.3 MTT檢測PPZ對胃癌干細胞生長的影響 ?PPZ對胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）增殖均有抑制作用，在48 h逐漸明顯;加入PPZ后，胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）兩個細胞系酶標儀檢測到的吸光值在48 h、72 h、96 h時均下降。72 h 和96 h時，加與不加PPZ的吸光值不同，統計學意義顯著（P<0.01），見表5、表6。

2.4 MTT檢測胃癌干細胞對5-FU的藥物敏感性 ?不同濃度（0～50 μg/ml）5-FU對胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）增殖抑制情況比較，差異無統計學意義（P>0.05）;而加入PPZ 100μg/ml后，隨著5-FU濃度的增加增殖抑制作用逐漸增強，在40～50 μg/ml濃度的5-FU對胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）增殖抑制更加明顯;加入PPZ 后，在40 μg/ml及50 μg/ml濃度的5-FU作用下胃癌干細胞（SGC7901-SP、HGC-27-SP）酶標儀檢測到的吸光值均降低，見表7、表8。

3討論

隨著研究的深入，目前許多學者認為胃癌也是一種干細胞疾病。腫瘤干細胞是存在于腫瘤內部的一小部分細胞，被認為是腫瘤起始、轉移和化療抵抗的源頭所在。越來越多的研究表明，胃癌干細胞參與胃癌的發生、發展、轉移和治療耐藥性[18-21]。耐藥性是目前腫瘤化療的最大障礙，腫瘤干細胞對化療藥敏感性較低，通過多種機制抵抗藥物的攻擊。胃癌干細胞不能被傳統化療清除，作為脫落的“種子”，種植到腹腔內導致腫瘤轉移進展[22]。在臨床治療中通過一定的方式提高腫瘤干細胞的化療敏感性，可以提高臨床治療療效[21]。

腫瘤酸性微環境是化療抵抗的一個重要機 ? ?制[23]，最近研究發現質子泵抑制劑（PPIs）能夠提高胃癌細胞的化療敏感性[16，24]，改變腫瘤微環境的酸度[25]。泮托拉唑（PPZ）是第三代PPIs，不可逆地滅活細胞膜上的H+/K+-ATP酶，抑制胃酸分泌。研究發現，胃癌細胞在PPZ作用后，對5-FU化療敏感性增加，而微球體形成能力和干細胞標記物CD44、CD24、ABCG2、EpCAM、Lgr5等的表達顯著下降，說明PPZ能抑制胃癌腫瘤干細胞，PPZ可能是一種新型的靶向治療胃癌干細胞的治療方法[26]。PPZ可明顯抑制耐ADR ?SGC-7901胃癌細胞株的侵襲及遷移，并可逆轉其上皮間質轉化[6]。體外裸鼠模型顯示，與單用阿霉素相比，PPZ 聯合阿霉素治療胃癌有更高的抗癌作用，且細胞毒作用減低[27]。在臨床試驗中，一項隨機前瞻性研究顯示高劑量的PPIs能改進乳腺癌患者化療療效，且副反應不明顯[28]。骨肉瘤特別是成軟骨細胞型患者，使用PPIs后能夠增加化療藥物的效果[29]。PPIs增加胃癌細胞化療藥物敏感性的機制可能與其逆轉跨膜pH值梯度[27]和下調耐藥基因表達[30]。

目前為止，有4種方法可以建立腫瘤干細胞模型：微球體培養、SP分選、流式細胞儀分選和免疫磁珠分選。在本研究中采用SP分選方法獲得胃癌干細胞。我們的研究發現加入PPZ后胃癌細胞系SGC7901、HGC-27的自我更新率明顯下降，胃癌干細胞系SGC7901-SP、HGC-27-SP的自我更新率也明顯下降，差異統計學意義顯著（P<0.01）。采用MTT試驗法檢測到PPZ、5-Fu 對胃癌細胞增殖有抑制作用;加入PPZ其抑制作用在48 h后出現，到96 h仍有一定的抑制作用;加入5-Fu 24 h后抑制增殖出現，在48 ～96 h時它變得顯著;5-Fu+PPZ聯合處理對胃癌細胞增殖的抑制作用最為明顯。PPZ對胃癌干細胞增殖也有抑制作用，抑制作用在48 h后出現，到96 h仍有一定的抑制作用，且能夠增加5-FU的化療敏感性。因此質子泵抑制劑（PPIs）可能成為逆轉胃癌腫瘤（干）細胞耐藥治療的一類聯合藥物。

PPIs抑制胃癌細胞增殖、逆轉化療抵抗性的機制尚不明確。有研究顯示PPZ通過STAT3信號通路抑制胃癌細胞系SGC-7901細胞的增殖，恢復其對順伯化療的敏感性[30]。Zhang B等[6]的研究發現PPZ可能通過靶向EMT和Akt/GSK-3β/β-catenin信號通路抑制耐阿霉素SGC-7901細胞的侵襲性。本的研究顯示PPZ能抑制胃癌（干）細胞的自我更新能力，提高5-FU化療敏感性，但其潛在的分子機制還需進一步探討。PPZ可能成為胃癌治療領域的一項新突破，為胃癌患者治療帶來新的希望。

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收稿日期：2019-7-22;修回日期：2019-8-2

編輯/肖婷婷