P38、MAPK-1和AQP-4在糖皮質激素調節(jié)大鼠創(chuàng)傷性腦水腫中的作用

方俊 姜永亮 黃波

摘要：目的 ?探討糖皮質激素對P38、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK-1）的調節(jié)作用及其對大鼠創(chuàng)傷后腦組織水通道蛋白 4（AQP-4）表達的影響。方法 ?選擇SPF級雄性SD大鼠140只，隨機分為假手術組、模型組、低劑量治療和高劑量治療組，各35只。假手術組單純實施開顱手術，模型組、低劑量治療組和高劑量治療組用Feeney's自由落體法制備大鼠腦創(chuàng)傷模型，高劑量治療組和低劑量治療組分別予高、低甲潑尼龍尾靜脈注射。分別于傷后0、6、24、72 h、7 d處死動物，取腦組織標本，透射電鏡觀察各組大鼠神經細胞結構變化，免疫組化法測定各組大鼠AQP-4、P38、MAPK-1的表達水平，用熒光探針原位雜交法測定AQP-4mRNA的表達。結果 ?①假手術組大鼠腦神經結構基本正常，細胞質、細胞膜及細胞核完整清晰。模型組神經細胞體積縮小，細胞膜結構破壞，胞漿疏松，細胞核固縮，凋亡小體形成。與模型組相比，低劑量治療組、高劑量治療組大鼠神經細胞壞死程度均較輕。②低劑量治療組及高劑量治療組大鼠傷后24、72 h及7 d的AQP-4陽性表達率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量與高劑量治療組間表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。低劑量治療組及高劑量治療組大鼠在傷后24、72 h及7 d的P38、MAPK-1陽性表達率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。③低劑量治療組和高劑量治療組的AQP-4mRNA陽性表達率在傷后24、72 h及7 d均低于模型組，高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 ?糖皮質激素可以降低大鼠創(chuàng)傷后腦組織AQP-4 的表達及腦損傷，其作用機制可能與抑制P38、MAKP-1激活、降低下游 AQP-4 的表達有關。

關鍵詞：顱腦創(chuàng)傷;腦水腫;水通道蛋白 4;P38;MAPK-1;糖皮質激素

中圖分類號：R743.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.019

文章編號：1006-1959（2019）21-0056-05

Abstract：Objective ?To investigate the effects of glucocorticoids on P38 and mitogen-activated protein kinase （MAPK-1） and their effects on the expression of aquaporin-4 （AQP-4） in rat brain after trauma. Methods ?A total of 140 SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group， model group， low-dose treatment and high-dose treatment group， 35 each. The sham operation group was only performed with craniotomy. The model group， the low-dose treatment group and the high-dose treatment group were prepared by Feeney's free fall method. The high-dose treatment group and the low-dose treatment group were given high and low methylprednisolone. Injection into the tail vein. The animals were sacrificed at 0， 6， 24， 72 h and 7 d after injury， and brain tissue samples were taken.The changes of nerve cell structure in each group were observed by transmission electron microscopy. The expression levels of AQP-4， P38 and MAPK-1 in each group were determined by immunohistochemistry. The expression of AQP4 mRNA was determined by fluorescence probe in situ hybridization. Results ?①In the sham operation group， the brain structure of the brain was basically normal， and the cytoplasm， cell membrane and nucleus were intact. In the model group， the volume of nerve cells was reduced， the cell membrane structure was destroyed， the cytoplasm was loose， the nucleus was pyknosis， and apoptotic bodies were formed. Compared with the model group， the degree of neuronal necrosis was lower in the low-dose treatment group and the high-dose treatment group. ②The positive expression rate of AQP-4 in the low-dose treatment group and the high-dose treatment group was lower than that in the model group at 24， 72 h and 7 d after injury，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the expression between the low-dose and high-dose groups （P>0.05）. The positive expression rates of P38 and MAPK-1 in the low-dose treatment group and the high-dose treatment group were lower than those in the model group at 24， 72 h and 7 d after injury，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference between the low-dose and high-dose groups （P>0.05）. ③The positive expression rate of AQP4 mRNA in low-dose treatment group and high-dose treatment group was lower than that in model group at 24， 72 h and 7 d after injury， which was significantly higher than that in sham operation group （P<0.05）.There was no significant difference between the low-dose and high-dose groups （P>0.05）. Conclusion ?Glucocorticoid can decrease the expression of AQP-4 and brain damage in rat brain after trauma， and its mechanism may be related to inhibition of P38， MAKP-1 activation and reduction of downstream AQP-4 expression.

Key words：Traumatic brain injury;Brain edema;Aquaporin 4;P38;MAPK-1;Glucocorticoid

創(chuàng)傷后腦水腫（cerebral edema）是顱腦損傷的重要病理生理過程，其發(fā)生由炎癥因子、神經血管活性物質、血腦屏障結構改變等眾多因素參與。盡管近年來臨床進行了大量的研究，但患者病死率、致殘率仍未顯著降低[1]。糖皮質激素（glucocorticoid，GC）是臨床廣泛用于治療各種炎性疾病和抗應激的藥物，其抗炎作用主要通過與糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）結合來實現(xiàn)。GR主要存在于細胞漿中，與GC結合后，能快速進入到細核內，通過多種通路發(fā)揮抗炎作用。其主要作用機制包括直接的轉錄過程調節(jié)，干擾其它轉錄因子的作用等[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，GR可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路來實現(xiàn)其抗炎作用。MAPK家族主要包括 ERK（extracelluar signal-regulated kinase）、JNK（c-Jun N-terminal kinase）和P38MAPK，它們都參與了機體炎癥反應的發(fā)生與發(fā)展過程。其中P38MAPK是各類炎癥反應的重要激酶，參與炎癥反應的發(fā)展與調節(jié)。研究證實，P38MAPK參與腦水腫的發(fā)生和發(fā)展，研究 GC與P38MAPK在創(chuàng)傷后腦水腫中的作用，有助于了解創(chuàng)傷后腦水腫的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，以及評估GC在腦水腫治療中的作用[3]。本研究主要探討糖皮質激素對大鼠創(chuàng)傷后腦組織P38、MAPK-1的調節(jié)作用及其對腦組織水通道蛋白 4（AQP-4）表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物 ?2016年2月～2018年3月選擇SPF級雄性SD大鼠140只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-00058，體重200～250 g。按照隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、低劑量治療組、高劑量治療組，各35只。本研究已通過我院實驗動物倫理委員會審批，實驗過程符合實驗動物倫理要求。

1.2試劑 ?二甲苯、蘇木精染液、1%伊紅酒精溶液、中性樹膠（國藥集團），抗 P38MAPK抗體（sc-7972）、抗P-P38MAPK（sc-7973）、抗MKP-1抗體（sc-1199）、抗AQP4抗體（Santa Cruz 公司），二抗（鈺森生物）。

1.3模型制備 ?假手術組僅行開顱手術，模型組、低劑量治療組、高劑量治療組參考 Feeney's自由落體模型制作重度創(chuàng)傷性腦損傷模型，致傷力約為1000 g/cm2，致傷面積約6～8 mm2，下陷深度約 ? ? ? 2 mm，造成右側頂葉重度腦損傷;高劑量治療組 ? 使用甲潑尼龍20 mg/kg，于傷后即刻首劑尾靜脈注入，之后每24 h注射1次，連續(xù)3次。低劑量治療組使用甲潑尼龍2 mg/（kg·d），1日劑量分3次注射， ?1次/8 h，于傷后即刻首劑尾靜脈注入。

1.4動物模型評分標準 ?大鼠蘇醒后立即按Zausinger法進行神經功能障礙評分：0分：大鼠不能自發(fā)行走;1分：大鼠自發(fā)活動時向損傷對側進行旋轉;2分：提起大鼠尾巴，大鼠向損傷對策進行旋轉;3分：對抗病變部位阻力減低;4分：病變另一側的前爪不能伸直;5分：無任何神經功能障礙;評分采用單盲法以減少誤差。選擇評分≤4分者，取出的腦組織檢查，確定有很明顯的腦損傷，視為造模成功。

1.5組織切片制備 ?達到預定時間（傷后0、6、24、72 h、7 d），各組分別取7只大鼠，麻醉大鼠，先后用4℃，0.9%氯化鈉注射液100 ml、4%多聚甲醛150 ml心臟灌洗，取腦，-80℃冰箱備用及固定、石蠟包埋。

1.6透射電鏡觀察神經細胞結構 ?2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制固定2 h。用0.1 M磷酸漂洗液漂洗，1%鋨酸固定液固定3 h，0.1 M磷酸漂洗液漂洗3次。4℃，50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、 90%丙酮（1∶1）、90%丙酮、100%丙酮分次脫水。純丙酮+包埋液（2∶1）室溫 4 h，純丙酮+包埋液（1∶2）室溫過夜，純包埋液37℃3 h。37℃烘箱內過夜，45℃烘箱內12 h，60℃烘箱內24 h固化。超薄切片機切片 50～60 nm。3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡觀察，拍片。

1.7免疫組化檢測AQP-4、P38、MAPK-1表達水平 ?取 4 μm 石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化處理后。立即投入3%H2O2甲醇（30%H2O2，1 ml，4 ℃避光+甲醇 ? ? 9 ml，現(xiàn)配現(xiàn)用）浸泡10 min。水洗3 min×2次，除去內源性的過氧化氫酶。抗原修復：①高壓鍋修復：立即投入檸檬酸緩沖液，等到沸騰，浮子升起，計時 ? ?2 min，自然冷卻至室溫。②血清修復：PBS 5 min/次，洗2次，擦干外圍，免疫組化筆勾圈，風干15 s。滴加5%BSA封閉液，然后放入37℃溫箱30 min，甩去多余液體。加一抗，1∶100稀釋，濕盒中于4℃冰箱中保存過夜。加二抗，恢復到室溫后，PBS洗3次，5 min/次，濕盒中置于37℃溫箱中0.5 h。加DAB-H2O2顯色，顯微鏡下控制顯色反應，蘇木素復染，中性樹膠封片。以細胞胞漿內棕褐色顆粒為陽性，掃描結果用圖像分析軟件（IMAGE J）處理，分析陽性表達率。

1.8熒光探針原位雜交檢測AQP-4mRNA表達 ?4%多聚甲醛固定組織，蔗糖脫水，OCT包埋切片。0.1 mol枸櫞酸緩沖液浸泡冰凍切片10 min，使組織細胞恢復水性。基因筆畫圈，滴加蛋白酶K（20 μg/ml）消化8 min。純水沖洗后PBS洗3次，5 min/次。預雜交，滴加預雜交液37℃恒溫箱1 h。雜交，傾去預雜交液，滴加雜交液（含探針AQP-4 probe濃度 8 ng/μl），37℃雜交過夜。雜交后洗滌，洗去雜交液，2×SSC，37℃洗10 min，1×SSC，37℃洗2次，5 min/次，0.5×SSC 37℃洗10 min。鏡檢拍照，切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍光;FAM（488）綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm，發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm，發(fā)紅光。陽性表達為相應熒光素標記的熒光。

1.9統(tǒng)計學處理 ?所有數(shù)據均由SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據以（x±s）表示，行t檢驗，統(tǒng)計分析釆用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組大鼠腦組織透射電鏡結果 ?假手術組大鼠腦神經結構基本正常，細胞質、細胞膜及細胞核完整清晰。模型組神經細胞體積縮小，細胞膜結構破壞，胞漿疏松，細胞核固縮，凋亡小體形成。與模型組相比，低劑量治療組、高劑量治療組大鼠神經細胞壞死程度均較輕。各組大鼠腦組織電鏡照片見圖1。

2.2各組大鼠腦組織AQP-4、P38與MAPK-1蛋白表達情況 ?大鼠腦組織AQP-4表達在傷后6 h降低，24 h開始增高，傷后72 h達到最高值，傷后7 d恢復正常水平;低劑量治療組及高劑量治療組大鼠傷后24 h、72 h、7 d的AQP-4陽性表達率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量與高劑量治療組間表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖2。大鼠腦組織P38、MAPK-1表達在傷后6 h開始增高，傷后72 h達到最高值，傷后7 d恢復正常水平。低劑量治療組及高劑量治療組大鼠在傷后24 h、72 h、7 d的P38、MAPK-1陽性表達率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖3、圖4。

2.3大鼠腦組織AQP-4mRNA表達結果 ?從熒光強弱判斷大鼠腦組織AQP-4mRNA的表達，其在傷后24 h開始增高，傷后72 h達到最高值，傷后7 d恢復正常水平。低劑量治療組和高劑量治療組的AQP-4mRNA陽性表達率在傷后24 h、72 h、7 d均低于模型組，高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖5。

3討論

P38、MAPK 是人體內廣泛分布的信號通路蛋白，可被炎癥反應、應激氧化與缺血缺氧等多種因素激活，在顱腦損傷后的病理生理信號傳導中起著重要作用。AQP-4是目前已發(fā)現(xiàn)的存在于動物中樞神經系統(tǒng)的主要水通道蛋白，對腦組織的水平衡調節(jié)起著主要作用[4]。AQP-4的表達受蛋白磷酸化，蛋白間相互作用，缺氧等因素的影響[5，6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組大鼠損傷腦組織 P38、MAPK-1、AQP-4 及 AQP-4mRNA 的表達增高且伴神經細胞破壞的增加，提示顱腦損傷后 P38-MAKP信號通路被激活，致使 AQP-4 高表達，進而促進腦水腫，加重神經損傷。P38 的激活對創(chuàng)傷后腦水腫有著重要作用，抑制 P38 的激活可有效減輕腦水腫。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，治療組大鼠損傷區(qū)域腦組織 P38、MAPK-1、AQP-4 及 AQP-4 mRNA的表達降低且伴神經細胞破壞減輕，提示糖皮質激素可以抑制 P38、MAPK-1的激活，導致AQP-4 的表達下調，減輕腦水腫，降低腦損傷。但是抑制P38、MAPK-1，并不能完全下調AQP-4的表達，提示AQP-4可能是創(chuàng)傷后腦水腫發(fā)生的重要的或最終的靶效應蛋白。損傷直接引起的細胞及膜結構的改變，受破壞細胞內成分異常流動，缺血缺氧再灌注損傷，有害神經遞質的釋放等多種原因均可以通過多種途徑引起AQP-4蛋白表達的改變，進而影響腦組織神經細胞內外水分子的流動分布[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質激素除了經典的基因組效應外還存在快速化非基因組效應，這一效應可以發(fā)生在中樞神經。這一快速化非基因組效應是GC直接透過血腦屏障與神經細胞GR結合，通過對細胞內信號系統(tǒng)的調節(jié)影響蛋白的轉錄表達。研究還發(fā)現(xiàn)GR在損傷腦組織中的表達水平降低，存在一定時相規(guī)律。在細胞水平，研究發(fā)現(xiàn)GC-GR結合后對MAPK系統(tǒng)的表現(xiàn)在：①直接或間接上調P38的表達;②抑制ERK的表達;③對JNK的作用具有細胞特異性。此外GC-GR還誘導上調MKP-1的活性和表達，對磷酸化的活性MAPK去磷酸化，進而滅活MAPK（主要是P38和JNK）。在急性肺水腫、缺血性腦水腫及一些腫瘤中，均證實了糖皮質激素的這種抑制作用，并通過這種抑制作用下調AQP的表達[8]。本研究證實了糖皮質激素作用的時間變化規(guī)律，并且還發(fā)現(xiàn)低劑量組與高劑量組比較，AQP-4、P38、MAKP表達結果沒有明顯差異。提示糖皮質激素對P38、MAPK-1的調節(jié)作用可能是通過與其位于神經細胞內的受體（GR）結合后發(fā)揮的，因此沒有明顯的量效關系，也解釋了部分臨床上糖皮質激素沖擊治療重型顱腦損傷效果不明顯的原因。

綜上所述，糖皮質激素可以降低大鼠創(chuàng)傷后腦組織AQP-4 的表達及腦損傷，其作用機制可能與抑制 P38、MAKP-1 激活、降低下游 AQP-4 的表達有關。然而，糖皮質激素對腦創(chuàng)傷后P38、MAPK-1及AQP-4表達的調節(jié)作用不具有量效關系，其對腦損傷的治療作用有待進一步研究。

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收稿日期：2019-9-11;修回日期：2019-9-23

編輯/成森