加減薯蕷丸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區TREM2及Iba1蛋白表達的影響

邱 靜，楊 瓊，譚子虎，謝文婷，王小燕

(1.湖北中醫藥大學中醫臨床學院，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫院老年病科，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease AD)是發生于老年和老年前期，以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性病變[1]。其患病率隨年齡增長而逐漸升高[2]。目前AD發病機制尚未闡明，其中β淀粉樣蛋白(amoyloid-beta，Aβ)沉積是AD發生發展的關鍵，也是導致其他病理改變的起始環節。Aβ沉積誘導小膠質細胞(microglial，MG)激活被認為是AD發病的核心病理機制之一。髓細胞觸發受體2(triggering receptor expressed on moyeloid cells 2，TREM2)是MG上表達的特異性基因，其R47H位點基因突變可以增加近3倍罹患AD的風險[3]。研究發現，調節TREM2表達水平可以影響MG功能，改善AD病理改變[4]。

AD屬于中醫“癡呆”“健忘”等范疇，中醫認為其病機為“髓減腦消、神機失用”，筆者臨證以健脾補腎、化痰祛瘀為法，擬方加減薯蕷丸，取得顯著療效。前期研究顯示，加減薯蕷丸可以抑制Aβ沉積，改善癡呆模型大鼠的認知功能，但其是否影響TREM2表達尚未進行相關研究。本實驗擬通過加減薯蕷丸干預AD模型大鼠，觀察其對AD模型大鼠海馬區TREM2和Iba1蛋白表達水平及對Iba1+細胞數量的影響，探討其改善AD認知功能的可能機制，為臨床應用提供更多證據支持。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠30只，購于湖北省實驗動物研究中心，生產許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，體質量(200±20)g，飼養于湖北省中醫院實驗動物中心，通過Morris水迷宮測試篩選出健康大鼠，隨機分為正常組、模型組、中藥組，每組10只。

1.2 實驗藥物 加減薯蕷丸：現為湖北省中醫院的院內制劑——薯蕷健脾益智合劑，批準文號為鄂藥制字Z20150027，由山藥、熟地黃、黨參、白芍、當歸等14味中藥組成，由湖北省中醫院藥材制劑科進行煎煮濃縮提純制備為口服液250 mL，真空包裝，每毫升含原藥材1 g。

2 方法

2.1 AD模型大鼠制備

2.1.1 Aβ1-42寡聚體制備 將Aβ1-42粉末加入預冷的200 μL六氟異丙醇(Hexafluoroisopropanol，HFIP)，使其最終濃度為1 mmoL/L；輕輕吹打瓶壁，使Aβ粉末充分溶解，在常溫下孵育60 min。隨后將其放在冰上5～10 min，轉移并分裝至離心管中，在室溫下使HFIP揮發，第2日用真空濃縮離心機使HFIP徹底蒸發，在離心管底可見一層薄膜，將薄膜置于-80 ℃中凍存。需要時再將膜取出，在二甲基亞砜中溶解，使其最終濃度為5 mmol/L；用F12培養基(不含有酚紅)進行稀釋，4 ℃下孵育24 h；14 000 r/min冰凍離心機離心10 min，最終形成的清液即為Aβ1-42寡聚體。

2.1.2 SD大鼠雙側側腦室注射Aβ1-42建立AD模型 參照文獻[5]制備AD大鼠模型，使用異氟烷對大鼠進行吸入麻醉。將處于麻醉狀態的大鼠固定于腦立體定位儀上，將大鼠顱頂正中部皮膚切開以充分暴露顱骨，用H2O2輕輕擦拭清理周圍組織，使前囟和中線都充分暴露。在中線旁左側1.5 mm，用鈍性注射器針頭輕鉆顱骨，用腦定位儀及微量進樣器在大鼠左側側腦室進行定位(前囟后0.8 mm，中線旁左側1.5 mm，深度4 mm)。用微量進樣器注射針，緩慢注入Aβ1-42 2 μL，注射時間>3 min，留針2 min，并緩慢撤針，防止注射的Aβ1-42從針道溢出。用同樣方法進行右側側腦室立體定位下注射Aβ1-42。注射完成后清理創口，縫合皮膚，并給予常規抗感染治療，注意觀察大鼠一般情況。模型復制1周后，采用行為學評分篩選模型復制成功大鼠。

2.2 給藥方法 各組模型復制成功的大鼠，7 d后開始灌胃：正常組、模型組大鼠每日給予10 mL/kg生理鹽水灌胃，參考前期研究文獻，加減薯蕷丸10 g/kg對大鼠發揮最佳劑量效應[6]，因此中藥組大鼠每日給予加減薯蕷丸10 g/kg灌胃，共灌胃4周。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 Western blot法檢測TREM2、Iba1蛋白表達水平 大鼠腹腔麻醉后直接斷頭取腦，冰上迅速分離雙側海馬，用于指標檢測。海馬組織勻漿后加入裂解液進行裂解，并對蛋白濃度進行定量；取等量組織加入蛋白變性劑，在100 ℃水中煮10 min使蛋白變性；取50 μg變性后蛋白用15% 蛋白凝膠電泳進行分離，后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脫脂牛奶進行封閉1 h后，孵育一抗(TREM2濃度為1∶100，Iba1及GADPH濃度為1∶1 000)4 ℃過夜；進行洗脫后滴加二抗，37 ℃下孵育2 h，洗脫后進行化學發光液顯色、曝光并進行定量分析。晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

2.3.2 免疫熒光染色觀察各組海馬區MG數量 大鼠腹腔麻醉后，生理鹽水灌注心臟。取大鼠海馬組織，用4%中性甲醛緩沖液實施固定。梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明處理，采用石蠟包埋切片(4 μm)。用二甲苯脫蠟處理，經不同濃度梯度乙醇進行水化處理，然后蒸餾水浸洗。用修復液(0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH 6.0)95 ℃孵育10～15 min，放置40 min使其冷卻到室溫。用山羊血清在常溫條件下封閉30 min；在避光的條件下采用標準化熒光素進行標記抗體，并在37 ℃的條件下孵育30 min，并用緩沖液沖洗浸泡處理，每次3 min。封片，并于暗室條件下采用熒光顯微鏡觀察。使用IPP 6.0軟件對免疫熒光照片進行光密度分析，每張切片選取3張400倍照片。

3 結果

3.1 各組大鼠海馬區TREM2、Iba1蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組TREM2蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組TREM2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Iba1蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖1、圖2。

3.2 免疫熒光染色 中藥組Iba1+細胞平均光密度值為(0.019 8±0.003 1)，模型組平均光密度值為(0.018 7±0.003 1)，正常組平均光密度值為(0.015 7±0.003 5)，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，中藥組海馬區Iba1+細胞數量明顯增加(P<0.05)。見圖3。

圖1Westernblot法檢測加減薯蕷丸對AD模型大鼠海馬區TREM2及Iba1蛋白表達水平的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

TREM2是在MG上表達的免疫受體，可通過與各種配體結合，如Aβ、載脂蛋白、脂蛋白或陰離子脂質，激活Wnt/β-catenin信號通路促進MG增殖，并通過Akt/GSK3β通路抑制MG凋亡；TREM2可以調節炎癥小體的關鍵成分，以抑制MG增生；TREM2還可以激活PI3K/AKT/mTOR通路，調節MG自噬并維持細胞能量和生物合成代謝，從而促進MG的存活[7]。TREM2作為感受因子探測細胞受損后釋放的脂類物質從而進一步引發細胞吞噬作用，TREM2在R47H位點突變會抑制細胞對脂類物質的敏感性，降低MG介導的吞噬作用，從而促進中樞神經系統(central nervous system，CNS)中的炎癥反應。TREM2除了上調參與AD調控，下調之后同樣可以參與AD調控。本研究發現，加減薯蕷丸可以降低AD模型大鼠海馬區TREM2蛋白表達水平。在AD患者及動物模型中本身存在TREM2蛋白的大量表達，這種表達的上調與Aβ區域分布及Aβ含量呈正相關[9]。減少TREM2表達，可以減少Aβ斑塊周圍相關巨噬細胞的聚集，減少神經炎癥因子的表達，同時可以減少Aβ的沉積[10]。6月齡SD大鼠比2月齡大鼠探究行為增多、學習記憶能力增強，其機制與海馬區TREM2蛋白水平下降有關[11]。阻斷MG上的TREM2信號可以減輕神經炎癥，可以在Tau蛋白病變環境中防治神經退行性變[12]。

圖3免疫熒光染色顯示各組大鼠海馬區Iba1+細胞(10×40倍，綠色箭頭示Iba1+細胞)

MG在CNS的損傷和修復中發揮重要作用，是CNS最重要的免疫防線[13]。MG參與AD發生和發展，Aβ沉積導致的MG激活在發病過程中起著雙重作用：Aβ沉積可以誘導MG趨化，使MG向Aβ沉積區域聚集，發揮吞噬作用；而激活MG可以分泌促炎因子和神經毒素，導致神經細胞損傷和死亡[14]。骨髓來源的巨噬細胞具有更強的Aβ吞噬能力，促進骨髓來源巨噬細胞向Aβ沉積區域趨化，增加其吞噬Aβ的能力，同時調節腦內MG的活化狀態由致炎的M1型向抗炎的M2型轉變，是AD防治的潛在靶點。Iba1是在一個17 kDa的鈣結合蛋白，可以同時標記巨噬細胞和MG[16]。在CNS內Iba1是MG特異性標記物[17]，但在本研究中，Iba1可能既標記了CNS內的MG，同時也標記了外周來源的巨噬細胞。正常情況下大腦存在完整的血腦屏障，外周巨噬細胞不容易穿過血腦屏障進入腦實質內，但本實驗模型復制過程中對大鼠腦結構完整性造成創傷，巨噬細胞通過損傷部位進入到CNS內，導致模型組海馬區Iba1的蛋白水平升高，免疫熒光染色顯示海馬區Iba1+數量明顯增多。經加減薯蕷丸干預后，中藥組Iba1蛋白水平和Iba1+細胞增加較模型組更多，加減薯蕷丸具有健脾補腎、化痰祛瘀的功效，腎藏精、主骨生髓、通于腦，通過補腎作用促進外周骨髓來源的巨噬細胞向腦內趨化，這與中醫“腎生髓充腦”理論具有一定的相似性，同時加減薯蕷丸組方中白芍、當歸、川芎等活血化瘀藥物可能在其中也起到重要促進作用。

加減薯蕷丸來源于漢代張仲景《金匱要略》中的薯蕷丸，由已故名老中醫呂繼端教授去其祛風之藥，取其補中之效，同時加用補腎填精、化痰開竅藥物以切合癡呆脾腎虧虛、痰瘀互結的病機化裁形成，方中山藥、熟地黃、制何首烏、杜仲、枸杞子、五味子滋補肝腎、填精益髓；黨參、白術、茯苓健脾益氣；石菖蒲、遠志化痰開竅益智；白芍、當歸、川芎活血祛瘀；全方共奏健脾補腎、化痰祛瘀、開竅益智之效。前期臨床研究顯示加減薯蕷丸可有效改善AD患者的簡易智力狀態檢查量表評分、AD評定量表認知部分評分及中醫證候積分[18]。前期動物實驗發現加減薯蕷丸可以減少腦低灌注模型Aβ沉積并減少Tau蛋白磷酸化水平[19]。現代藥理學研究也證實，加減薯蕷丸方中多種中藥及其有效成分可以起到改善AD病理和認知功能的作用。如石菖蒲中有效成分β細辛醚可以通過核因子κB信號通路抑制MG的活化，從而發揮抗炎作用[20]。白芍總苷可以通過抑制MG過度激活及炎癥細胞因子的過表達，改善Aβ沉積導致的海馬區炎癥反應[21]。遠志提取物可以通過調節腦源性神經營養因子及其受體酪氨酸受體激酶受體B信號通路促進Aβ降解，改善AD小鼠的學習記憶功能[22]；遠志總皂苷可通過提高AD模型大鼠海馬區nAChRα7的表達，改善AD大鼠的認知功能[23]。山藥可以通過增強腦組織ATP酶活性提高機體抗氧化能力，改善癡呆小鼠認知功能[24]。

AD的發病機制存在多種假說，Aβ瀑布學說在其中占據核心地位，Aβ可與MG上多種受體結合，引起多條信號通路激活的級聯反應，而這些激活的通路又經過彼此之間的相互作用而影響器官、細胞等最終功能狀態。本研究發現，加減薯蕷丸可以降低海馬區TREM2蛋白水平表達，同時增加海馬區Iba1+細胞數量，推測加減薯蕷丸可能通過減少Aβ介導的神經炎癥，同時增加發揮吞噬Aβ作用的外周巨噬細胞數量來發揮改善AD病理的作用。但AD本身發病機制復雜，加減薯蕷丸作用于AD的相關機制仍需要進行深入研究。