桑黃正丁醇提取物對白念珠菌生物膜形成的抑制作用

汪天明，邸 磊，施高翔，劉慧敏，汪長中，李 寧

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032；2.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012)

白念珠菌(Candidaalbicans)是一種常見的條件致病真菌[1]，平時定植于人體的皮膚、口腔、胃腸道及陰道等部位，當機體抵抗力降低或菌群失調時，白念珠菌會過度增殖，引起上述部位的感染[2]。有研究表明,醫院內條件性真菌感染中78%～80%是由該菌引起[3]。

在體外，白念珠菌在一定條件下還可附著在植入的醫療設備上，形成能夠耐受高濃度抗真菌藥物的生物膜。生物膜主要由包埋于其中的菌體及β-葡聚糖和細胞外DNA等組成。生物膜狀態的菌體不僅耐藥，還能夠引起慢性感染。對于白念珠菌生物膜，目前尚無有效的西藥進行干預[4]。

中藥桑黃(Phellinusigniarius)在臨床上具有活血、止血、化瘀、抑菌、止瀉之功效[5-7]。課題組前期研究發現，桑黃提取物對白念珠菌具有一定的抑制作用。故本實驗擬探討桑黃正丁醇提取物(butyl alcohol extract ofphellinusigniariusdecoction，BAEP)對白念珠菌主要致病因素之一即生物膜的影響，旨在為其可能用于治療白念珠菌提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與菌株 ①白念珠菌(Candidaalbicans)標準株SC5314：由海軍軍醫大學藥學院姜遠英教授惠贈。②桑黃：由安徽醫科大學藥學院李寧教授實驗室提供。③BAEP制備：取桑黃子實體粉適量，加8倍70%甲醇回流提取3次，每次2 h，合并濾液，真空回收溶劑，得濃縮物，濃縮物水分散后，依次用10倍容積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，真空揮干溶劑，分別得到桑黃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4部分提取物。④陽性對照藥物為氟康唑(fluconazole，FLZ)(批號 J09M6B1):由上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 試劑及材料 XTT粉(批號 F523BA0012)：加拿大BBI公司；熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，FDA)(批號 F16551)：上海翊圣科技有限公司；25%戊二醛(批號 0715A19)、PBS(批號 0428A16)：雷根生物技術有限公司；ALS1、HWP1引物：上海生工生物工程有限公司；Total RNA提取試劑(批號 742100)、PCR反應試劑(批號 841200)：日本ToyoBo公司；DEPC處理水、Zemolyase酶(批號 SLBP5261V)：金克隆(北京)生物技術有限公司；無水乙醇(批號 20190710JN)：天津市大茂化學試劑廠；瓊脂糖(批號 182195)：上海滬試分析儀器有限公司；TAE(批號 690674223)：上海聯邁生物工程有限公司；RPMI 1640(批號 2023235)：美國Life technologies；沙氏培養基(批號 20190425)：青島高科技海博生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器 電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；血細胞計數板：上海求精生化試劑儀器有限公司；CKX41-32型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；DMI60000B倒置熒光顯微鏡：德國徠卡光學儀器公司；Regulus 8100冷場發射式掃描電鏡：日本日立公司；K3型酶標儀：賽默飛世爾科技公司；ABI 7500熒光定量PCR儀：美國應用生物系統公司。

2 方法

2.1 菌液配制 按文獻[8]方法配制菌液。從4 ℃保存的沙氏瓊脂平板上挑取白念珠菌單菌落，接種至液體沙氏培養液，37 ℃恒溫過夜培養，血細胞計數板計數，RPMI 1640(pH 7.0)培養液稀釋集落形成單位(colony forming unit, CFU)至2×106/mL，備用。

2.2 BAEP對白念珠菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)及抑制50%生物膜的最低抑制濃度(sessile minimal inhibitory concentration，SMIC50)的測定 按照文獻[8]方法，取100 μL菌液(CFU 2×103/mL)與100 μL終濃度分別為32、64、128、256、512、1 024 μg/mL BAEP及0.5、1、2 μg/mL FLZ于96孔板中混合，另設不含藥物的陰性對照孔，于37 ℃培養48 h后，以肉眼觀察不到菌落的最低藥物稀釋度為MIC，實驗平行重復3次。

取CFU為2×106/mL的菌液100 μL，與100 μL終濃度分別為32、64、128、256、512、1 024 μg/mL BAEP及64、128、256 μg/mL FLZ于96孔板中混合，另設不含藥物的陰性對照孔，37 ℃培養24 h后，每孔中加入50 μL XTT-維生素K3溶液，避光孵育2 h。使用多功能酶標儀檢測492 nm處各孔的吸光度(optical density, OD)值。與空白組比較，以OD值降低50%的藥物濃度為SMIC50。SMIC50的測定實驗獨立重復3次。

2.3 固體培養基上觀察BAEP對白念珠菌菌落形態的影響 按文獻[9]方法配制沙氏固體培養基，加入終濃度為256、512、1 024 μg/mL的BAEP，另設不含藥物的空白對照組。用倍比稀釋法將白念珠菌懸液中CFU稀釋至20/mL，取100 μL于固體培養基上，用稀釋涂布法涂布均勻。37 ℃培養6 d后，以數碼相機拍攝菌落形態。

2.4 倒置顯微鏡下觀察白念珠菌酵母生物膜形態 取CFU為2×106/mL的菌液1 mL，與1 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg/mL BAEP及64 μg/mL FLZ于6孔板中混合，另設不含藥物的陰性對照孔，37 ℃培養24 h后，以倒置顯微鏡拍攝生物膜形態[8]。

2.5 熒光顯微鏡下觀察白念珠菌生物膜活性 取CFU為2×106/mL的菌液1 mL，與1 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg/mL BAEP及64 μg/mL FLZ于6孔板中混合，另設不含藥物的陰性對照孔，37 ℃培養24 h后，吸棄上清液，之后加入100 μg/mL的FDA熒光染料溶液，避光37 ℃染色30 min，以熒光顯微鏡拍攝生物膜形態。

2.6 掃描電鏡下觀察白念珠菌生物膜形態結構 取CFU為 2×106/mL菌液2 mL與2 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg/mL BAEP及64 μg/mL FLZ混合置于6孔板，另設不含藥物的陰性對照孔，分別放入經高溫滅菌處理的硅橡膠導管，恒溫37 ℃培養24 h后，將導管取出，置2.5%戊二醛中，避光4 ℃放置2 h，依次置于35%、50%、75%、95%、100%乙醇逐級脫水各10 min，經室溫過夜干燥后，經HVS-GB型真空蒸鍍儀噴金，用掃描電鏡觀察拍照。

2.7 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測白念珠菌生物膜特異性基因的轉錄水平 ①RNA的提取及逆轉錄：CFU為2×106/mL的菌液2 mL與2 mL終濃度分別為1 024、512、256 μg/mL BAEP混合，37 ℃共培養24 h后，離心，收集菌體，用無菌PBS洗2次后進行RNA的提取(參照MagExtractor-RNA試劑盒說明書操作)。②引物的設計與合成：委托上海生工合成引物。ACT1的正向引物(5′→3′)為GCTGAACGTATGCAAAAGGAA，反向引物(3′→5′)為TGTGGTGAACAATGGATGGA；ALS1的正向引物為CACCAAACTACACGGTTAC，反向引物為ATAATGAGGACGGGAAAA；HWP1的正向引物為TGACTATCCACAACAGCCACAAGAAC，反向引物為GTCACAAGGAACACTAGGTTGAGGAG。③實時熒光定量PCR反應：采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒，配制PCR反應體系25 μL，反應在ABI7 500熒光定量PCR儀器上進行，實時熒光定量PCR分析分別測定目的基因ALS1、HWP1和內參基因ACT1的Ct值，實驗平行重復3次，結果取其平均值。采用2-ΔΔCt法[10]檢測基因轉錄水平。

3 結果

3.1 BAEP對白念珠菌SC5314的MIC和SMIC50BAEP對白念珠菌菌落吸光度有明顯影響，并且隨BAEP濃度升高，白念珠菌菌落OD明顯降低；BAEP對白念珠菌SC5314的MIC是1 024 μg/mL，1 024 μg/mL BAEP對白念珠菌生物膜的抑制率可達60%以上，128、256、512 μg/mL BAEP抑制生物膜效果明顯。

3.2 BAEP對白念珠菌在固體培養基上菌落形態的影響 觀察固體培養基上菌落形態發現，空白對照組菌落出現大量褶皺，邊緣不光滑，256 μg/mL BAEP組出現大量褶皺，邊緣不光滑，邊緣不光滑程度小于空白對照組；512 μg/mL BAEP組表面出現少量褶皺，邊緣略光滑，1 024 μg/mL組表面光滑，邊緣光滑。見圖1。

注：A.空白對照組；B. 256 μg/mL BAEP組；C. 512 μg/mL BAEP組；D. 1 024 μg/mL BAEP組

圖1各組白念珠菌在固體培養基上的菌落形態

(上行圖片：1倍大??；下行圖片：倒置顯微鏡下觀察，10×40倍)

3.3 倒置顯微鏡下BAEP對白念珠菌生物膜形態的影響 倒置顯微鏡下發現，空白對照組出現大量菌絲，FLZ組未發現明顯菌絲，256 μg/mL BAEP組菌絲數量較陰性對照組有所減少，512 μg/mL BAEP組更進一步減少，1 024 μg/mL BAEP組不僅菌絲數量明顯減少，且長度也明顯縮短。見圖2。

3.4 熒光顯微鏡下BAEP對白念珠菌生物膜活性的影響 經FDA染色，熒光顯微鏡下發現，空白對照組因真菌活力最高，熒光最強；FLZ組熒光強度最弱；256、512、1 024 μg/mL BAEP組白念珠菌的活性、熒光強度隨藥物濃度遞增而減弱。見圖3。

3.5 掃描電鏡下BAEP對白念珠菌生物膜形態的影響 掃描電鏡結果顯示，空白對照組的白念珠菌生物膜由密集的縱橫交錯的菌絲構成，256 μg/mL BAEP對白念珠菌生物膜的抑制效果并不明顯，512 μg/mL BAEP有一定抑制作用，1 024 μg/mL BAEP對白念珠菌生物膜有明顯的抑制作用，未見構成生物膜的主要組分即菌絲。見圖4。

3.6 BAEP對白念珠菌生物膜相關基因表達的影響 256 μg/mL HAEP顯著下調HWP1基因的表達水平(P<0.05)，顯著上調ALS1基因的表達水平(P<0.05)，而512 μg/mL HAEP對ALS1和HWP1基因的表達水平無顯著影響(P>0.05)。見表1。

表1 BAEP對白念珠菌生物膜ALS1、

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與FLZ組比較，#P<0.05；與256 μg/mL BAEP組比較，△P<0.05

4 討論

近年來，隨著廣譜抗生素、糖皮質激素和免疫制劑的廣泛使用，外科介入療法的不斷增多，免疫功能低下患者不斷增多，真菌尤其是深部真菌感染的發生率日漸增高，其中以白念珠菌的感染最為常見[12]。

在自然界以及人體中，白念珠菌往往以生物膜狀態形式存在。不同于單個的浮游菌體，生物膜是菌體不可逆地粘附在無活力物體或活組織表面形成的一個由自身產生的細胞外基質包裹菌體集群體[13]。白念珠菌生物膜主要由大量菌絲及其分泌的基質所組成，生物膜對所包裹的菌體形成一種保護，使其對臨床上目前所用的抗真菌藥物高度耐受[14]。因此，近年來針對白念珠菌生物膜狀態的藥物研發成為藥學和真菌學領域的研究熱點。現有的抗真菌西藥不僅研發周期長，且對人體的毒性和不良反應也較大，故而從中藥中篩選發現抗生物膜活性的藥物成為一個重要渠道。本課題組前期研究表明，中藥及其有效成分具有良好的抑制白念珠菌作用[15-16]。

已有研究表明，中藥桑黃具有抗腫瘤、調節免疫、抗肝纖維化、抗氧化、降血糖、消炎抗菌等藥理作用[17]。本實驗采用XTT還原法測試BAEP對白念珠菌生物膜形成能力，結果發現，1 024 μg/mL的BAEP可以抑制白念珠菌60%生物膜形成能力。在固體培養基上，對照組菌落邊緣不光滑，大量褶皺，512 μg/mL BAEP組菌落有少量褶皺，邊緣略光滑；1 024 μg/mL BAEP組菌落表面光滑，邊緣光滑。這說明BAEP對白念珠菌生物膜的形成有一定的抑制作用。

注：A.空白對照組；B.FLZ組；C.256 μg/mL BAEP組；D.512 μg/mL BAEP組；E.1 024 μg/mL BAEP組

注：A. 空白對照組；B. FLZ組；C.256 μg/mL BAEP組；D.512 μg/mL BAEP組；E.1 024 μg/mL BAEP組

注：A. 空白對照組；B.FLZ組；C.256 μg/mL BAEP組；D.512 μg/mL BAEP組；E.1 024 μg/mL BAEP組

倒置顯微鏡下觀察到空白對照組生物膜較厚，菌絲密集；256、512 μg/mL BAEP組生物膜較厚，但小于空白對照組；1 024 μg/mL BAEP組菌絲較少且長度也明顯縮短，生物膜不明顯。結果說明BAEP對白念珠菌生物膜的形成有一定的抑制作用。

FDA是一種用于細胞活力測定的熒光載體。只能染活細胞，且細胞活力越強，熒光強度越強[18]。在本實驗中，不同濃度的BAEP作用后的生物膜經FDA染色后，發現空白對照組的熒光強度最高，并且隨著BAEP濃度遞增，熒光強度逐漸減弱。這說明在BAEP 的作用下白念珠菌活力減退，故被FDA染色后熒光強度較弱。

掃描電鏡結果顯示，1 024 μg/mL BAEP對白念珠菌生物膜有明顯的抑制作用，主要表現在抑制其菌絲的形成。

白念珠菌生物膜形成受相應的基因調控。HWP1與ALS1是已經發現的參與白念珠菌生物膜形成的基因。qRT-PCR檢測結果發現，BAEP明顯降低HWP1的表達水平，但同時上調ALS1的表達水平。這可能是白念珠菌受到環境壓迫(本研究中的藥物BAEP)時采取的一種本能性的代償反應。

本研究表明，BAEP對白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用，抗菌效果明確，但其抗菌的有效組分以及詳細的作用機制尤其是體內的抗真菌作用尚有待于進一步深入研究，這將為拓寬桑黃潛在的臨床用途提供一定的科學依據。