昆侖雪菊表型性狀及分子標記的遺傳多樣性研究△

樊叢照，郎乾坤，朱軍，王果平，宋海龍，李曉瑾*

1.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所/國家中醫藥管理局 新疆中藥民族藥資源重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830002；2.阿克蘇市人民醫院，新疆 阿克蘇 843000

21世紀初，在和田援疆的干部發現，當地盛行飲用一種產自當地高海拔稱之為“古麗恰爾”的花茶，氣味濃郁，神清氣爽。援疆干部們在給親朋好友介紹時，根據產地和外觀取名為“昆侖雪菊”。相傳其分布于克里昂鄉3000 m左右的高山草甸，極為稀少，市場多為采擷該野生種子栽培的產品。然而經植物分類學專家鑒定，“昆侖雪菊”系菊科雙色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.，原產于北美，為我國引種觀賞花卉品種。但研究表明無論是植物形態還是化學組成，源于和田地區的本品與其他地區的皆有所不同[1]。

表型性狀的統計分析是種質資源研究最基本的方法[2]，具有數據收集快、經濟等優點[3]；分子標記能夠直接精確地反映出遺傳物質的差異，并表現出更高的多態性[4]，其中簡單重復序列區間(inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)具有操作簡單、快速高效、遺傳多態性高、重復性好等特點[5]，在藥材產地評價和遺傳多樣性研究等方面已有廣泛應用[6-8]。因此，本研究擬使用表型性狀統計及ISSR分子標記等方法，研究不同區域雪菊種質資源表型性狀與遺傳物質的多樣性，揭示不同產地間的差異，為正確定位“昆侖雪菊”提供科學依據，對發掘當地特色產品、服務于精準扶貧，具有十分重要的現實意義和科學價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 收集不同產區的19份雪菊種質資源，2016年5月種植于新疆昌吉職業技術學校試驗田，試驗條件一致。2016年8月分別采集120株的新鮮葉片，保存于-80 ℃冰箱備用，樣品信息見表1。

表1 昆侖雪菊種質來源與樣品信息

1.1.2 試劑 異丙醇(分析純)；乙醇(分析純)；Tris平衡酚(北京索萊寶科技有限公司)；RNase A酶(天根生化科技北京有限公司，批號：RT405-02)；2×TaqPCR MasterMIX(博邁德生物)；ISSR引物(參照British Columbia大學公布的引物序列，由上海生工合成)。

1.1.3 儀器設備 Anker TGL-16C型離心機(上海安亭科學儀器有限公司)；070-851PCR型擴增儀(An Analytik Jena company)；恒溫金屬水浴鍋(天根生化科技北京有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀統計 測定每株供試品的株高(ZG)、徑粗(JC)、冠幅(GF)、分枝數(FZS)、第一分支的高度(FZG))、葉長/葉寬(YCK)、花冠直徑(HG)、花蕊直徑(HR)、花色(HS花瓣上的紅色區域)、花瓣數(HBS)10個表型性狀。

1.2.2 DNA提取及檢測 采用改良CTAB區室法[9]，提取樣品DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小及質量。

1.2.3 PCR擴增及檢測 ISSR-PCR反應體系25 μL，包括2×TaqPCR MasterMIX 12.5 μL，H2O 9 μL，引物2.5 μL，DNA模板1 μL。反應條依次為預變性3 min；變性30 s，退火30 s，延伸30 s，循環35次；延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.3 數據處理

1.3.2 ISSR-PCR擴增結果處理 對ISSR引物擴增條帶進行賦值：清晰條帶記作“1”，沒有條帶記作“0”；用POPGENE處理0/1矩陣圖，計算多態位點百分率(PPB)、有效等位基因數(Ne)、Nei′s遺傳多樣性指數(H)、Shannon′s信息指數(I)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內的基因多樣性(Hs)、群體間的遺傳分化系數(GST)、基因流(Nm)；按非加權配對法(UPGMA)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 表型性狀的極差分級及多樣性分析結果

120份樣品的表型性狀結果如表2所示，遺傳多樣性信息指數(H)大小依次為：株高>花冠=花色>莖粗>葉長/葉寬>冠幅>分枝數>第一分支的高度>花瓣數>花蕊直徑。表型性狀中株高的變異度和豐富度最大，為2.16；最小的是花蕊直徑，為1.07。

表2 昆侖雪菊在表型性狀各級別的分布量及其遺傳多樣性信息指數

2.2 表型性狀的聚類分析

雪菊19個采集地的10個平均表型性狀聚類后被分為2類(如圖1)。第一類包括溫泉縣、蘭州市、吐魯番市、布爾津縣、于田縣、達坂城、阿拉爾、和田縣，其中溫泉縣和蘭州市的平均表型性狀最近，其次是布爾津縣和于田縣。第二類包括民豐縣1～2號、皮山縣的1～5號、未知1～2號、特克斯、烏魯木齊市；其中民豐縣1號和2號的平均表型性狀最近；其次是未知2號，烏魯木齊市、皮山縣1號和5號，未知1號和特克斯縣。

圖1 雙色金雞菊19個采集地表型性狀聚類圖

2.3 ISSR遺傳多樣性統計結果

14條引物共擴增出263個位點，分子量在100～5000 bp，不同引物擴增的多態位點數從13到24個不等，平均每個引物檢測到18.78個位點，如圖2，其中多態位點255個，占96.96%。總的Ht為0.292 2，種群內的Hs為0.149 8，種群間的Dst為0.142 4。物種水平上，PPB為96.96%、Ne為1.464 4，H為0.281 1，I為0.432 1；居群水平上，各種群的PPB差異較大，平均值為42.13%，平均有效等位基因數為1.259 0，平均H和I分別為0.149 8、0.223 1。見表3～4。

表3 ISSR反應體系中所使用引物的信息及擴增結果

表4 昆侖雪菊的遺傳多樣性參數

圖2 引物841對昆侖雪菊供試樣品1～30的擴增圖譜

2.4 群體的遺傳分化

POPGENE計算得到種群間的基因GST為0.487 4，即48.74%的遺傳變異來源于種群間，51.26%的遺傳變異來源于種群內；雙色金雞菊種群間Nm為0.525 9<1，表明基因交流處于低等水平；19個采集地之間的Nei′s遺傳一致度在0.660 9～0.948 8，平均值0.824 0；遺傳距離分布在0.052 6～0.414 1，平均值0.196 2。其中皮山縣5號和達坂城兩采集地之間的遺傳一致度最高(0.948 8)，遺傳距離最小(0.052 6)。

2.5 不同產地的聚類分析

19個雪菊采集地UPGMA聚類結果(如圖3)在第15步被聚為5類：未知1號和特克斯縣被聚為第一類；皮山縣1～3號被聚為第二類；布爾津縣、阿拉爾市、皮山縣4～5號、民豐縣、溫泉縣、和田縣、達坂城、蘭州市、于田被聚為第三類；未知2號、烏魯木齊市、民豐縣被聚為第四類，吐魯番市被單獨聚為第五類。

3 討論

為了消除環境因素的干擾，本研究將來源于不同產地的雙色金雞菊種質資源在同一產地種植，并保證生長條件一致性。數量性狀統計結果表明，不同種質資源的雙色金雞菊外觀形態呈現顯著差異，除了株高、徑粗、冠幅等數量性狀存在顯著差異外，花色(花瓣上的紅色區域面積)也存在顯著的差異。總體來看，來源于平原地區的種質資源和來源于高海拔地區的種質資源分為兩大類群，這表明，環境因素可能在一定程度上影響了雙色金雞菊遺傳物質的分化。

遺傳多樣性研究結果表明，雙色金雞菊遺傳多樣性指數為0.281 1，大于同科藥用菊花(PPB=81.87%，H=0.219 1)[11]，有較高的遺傳多樣性，決定了其較強的環境適應能力，因此雙色金雞菊能夠在新疆各種生態環境下引種成功。但從Nm指數來看，雙色金雞菊種群間基因交流處于較低水平，這也進一步證明了雙色金雞菊在不同環境長期引種栽培過程中遺傳物質發生了區域性的遺傳分化，實際表現在不同產區表型性狀、氣味、浸出液色度、有效成分[12-13]等方面的差異，因此導致市場上也出現了質量和外觀參差不齊的雪菊產品。

在全球尺度上植物的遺傳物質與緯度、氣候因素之間存在顯著的非線性關系[14]。在和田昆侖山地區生長的雙色金雞菊與環境相適宜，產生了適合本地區環境的遺傳分化。ISSR遺傳多樣性分析結果表明，生長在皮山縣干旱、高寒、高海拔地區的昆侖雪菊在遺傳物質上顯示出較強的地域性和道地性，因此，昆侖山區產的昆侖雪菊無論在品質還是價格上都長期保持著巨大的優勢。雖然環境會對雪菊的品質造成一定的影響，但近些年由于盲目的人工栽培導致原始的種質與其他地區種質發生基因交流，也是造成昆侖雪菊種質混亂、品質良莠不齊的一個重要因素，因此保護昆侖雪菊原產地的種質資源對保持昆侖雪菊的市場競爭力具有重要的意義。

圖3 基于ISSR的昆侖雪菊19個采集地的遺傳聚類圖