稻瘟病菌精氨酸甲基轉移酶基因MoHMT1 的功能分析

張文澤 張艷麗 門彥明 張玉嬌 孫志昕 李文慧 魯國東齊堯堯

（1. 臨沂大學農林科學學院，臨沂 276005；2. 福建農林大學植物保護學院，福州 350002）

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病常常爆發成災，造成水稻減產高達50%，每年造成的糧食損失足以養活六千萬人口，嚴重威脅著全球糧食安全［1］。稻瘟病菌作為研究寄主-病原真菌相互作用、絲狀真菌侵染致病機理的重要模式生物，其侵染水稻的過程經歷了分生孢子的萌發、芽管的產生、附著胞和侵入栓的形成、以及侵染菌絲的生長和致病等過程［2］，涉及到了復雜的蛋白質翻譯后修飾。隨著研究的深入，蛋白質精氨酸甲基化越來越受到研究者的青睞［3］，且關于催化其發揮作用的蛋白質精氨酸甲基轉移酶（Protein arginine methyltransferases，PRMTs）的研究也越來越多。

PRMTs 普遍存在于真核生物中，主要催化硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）上的甲基轉移到靶蛋白精氨酸殘基末的胍基上，進而調控著DNA 修復、信號轉導、細胞發育以及癌癥發生等過程［3-5］。根據催化形式的不同，PRMTs可以分為4 種類型：Type I 主要催化形成單甲基化（Monomethylated arginine，MMA）和非對稱二甲基化（Asymmetric dimethylated arginine，ADMA）；Type II 主要催化形成MMA 和對稱二甲基化（Symmetric dimethylated arginine，SDMA）；Type III 只 催 化 形成MMA，而Type IV 則 催 化 形 成δ-MMA［6-7］。到目前為止，報道最多的是Type I 和Type II 的PRMTs［4，6］，而鑒定出的3 個Type III PRMTs 分別來自人類（human）［8］、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［9］和布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）［10］，Type IV PRMT 僅在S. cerevisiae［11］中有報道。

PRMT1 是Type I 中最主要的精氨酸甲基轉移酶，在真核生物中是高度保守的。哺乳動物中對PRMT1 的研究最為透徹，研究發現人類中的PRMT1是正常胚胎、細胞周期進程、細胞移動和信號轉導所必需的［4-5，12-13］。植物中對PRMT1 的研究相對較少，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）中初步鑒定出PRMT1 的同源蛋白是AtPRMT1a 和AtPRMT1b，這兩個蛋白都定位于細胞質和細胞核中，在體外能催化RNA 甲基轉移酶AtFib2、纖維蛋白和組蛋 白H4［14］。 此 外，AtPRMT1b（PRMT11） 能 與MBD7（methyl-DNA-binding protein 7）相互作用，但是AtPRMT1a和AtPRMT1b的單突變體或雙突變體在長日照條件下都沒有任何明顯的表型［15］。水稻中PRMT1 的同源蛋白OsPRMT1 也定位于細胞質和細胞核中，且在水稻的各個組織中都能表達，其中成熟葉片中表達量最高，體外具有甲基轉移酶的活性［16］。

在真菌中，釀酒酵母（S. cerevisiae）中的Hmt1p是首次報道的PRMT1 同源蛋白，該蛋白定位于細胞核中，雖然并不是酵母生長所必需的，但其催化活性卻是Npl3p 和Cbp80（cap-binding protein 80）缺失突變體所必需的［17-19］。此 外Hmt1p 除甲基化組氨酸和非組氨酸蛋白外［17-18，20-22］，還可以甲基化小核糖體蛋白S2（Small ribosomal protein S2，Rps2）［23］。白色念珠菌（Candida albicans）中的CaHmt1 與Hmt1p 功能類似［24］。近幾年絲狀真菌中的PRMT1/Hmt1p 同源蛋白的研究已取得了一些進展，例如禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）AMT1基因在菌絲生長、應對脅迫反應、產生毒素和侵染植物等過程中都發揮了重要的作用，且該蛋白調控著FgHrp1 的甲基化和核運輸過程［25］；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中AMT-1基因缺失后導致菌絲伸長速率降低，并增強了對麥角固醇生物合成抑制劑伏立康唑的敏感性［26］。與此不同的是，構巢曲霉（Aspergillus nidulans）中RmtA基因缺失后并沒有影響該菌的營養生長、有性孢子和無性孢子的產生，但是會導致氧脅迫條件下生長明顯減慢［27］。此外，黃曲霉（Aspergillus flavus）RmtA 蛋白作為一個全局調控因子，既負調控著孢子的產生，又促進菌核的發育，正向調控著次生代謝過程，控制黃曲霉毒素和其他未知代謝物的產生［28］。

稻瘟病菌（M. oryzae）中含有4 個PRMT 基因（MoPRMT 1-4），生物信息學分析發現它們均含有保守的甲基轉移酶結構域，在絲狀真菌中是高度保守的［29］，其中MoPRMT1 與MoPRMT2、MoPRMT3、MoPRMT4 的序列相似性分別為43%、44%和34%，表達譜分析結果表明MoPRMT1 在侵染后24 h 表達量達到最高峰，而其他階段表達水平基本一致［29］，然而該基因在稻瘟病菌侵染循環過程中發揮的具體作用尚未報道。根據真菌基因的命名規律，參照酵母中同源基因的名稱，本研究將編碼PRMT1 蛋白的基因MGG_04584 重新命名為MoHMT1（hnRNP arginine N-methyltransferase），并利用同源重組的基因敲除技術，分析其在稻瘟病菌生長發育和侵染致病過程中的作用，為進一步揭示稻瘟病菌MoHMT1的生物學功能及其參與的信號途徑提供基礎，也有利于進一步闡明稻瘟病菌的致病分子機理。

1 材料與方法

1.1 材料

稻瘟病菌菌株Ku80由美國普渡大學許金榮博士惠贈；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、水稻品種CO39 均為本實驗室所保存；PCR 試劑、限制性內切酶、T4 DNA 連接酶等均購于大連寶生物公司；其他常規生化試劑均為國產分析純；引物合成（表1）及DNA 測序分析均由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1MoHMT1基因的敲除 根據同源重組的原理，以稻瘟病菌菌株Ku80基因組DNA 為模板，通過MoHMT1的上下游引物（表1）分別擴增其上下游片段A 和B，然后分別與潮霉素磷酸轉移酶基因H 片段混合作為模板，利用SOE-PCR 技術擴增獲得AH 和HB 片段，進行原生質體的轉化［30］。挑選具有潮霉素抗性的轉化子，利用PCR 的方法篩選基因敲除的陽性轉化子。

1.2.2Mohmt1敲除突變體菌落形態觀察和生長速率測定 將生長活力大致相同的野生型菌株Ku80、敲除突變體ΔMohmt1-14菌株、ΔMohmt1-19菌株和異位整合突變體Mohmt1-Ect菌株分別挑取大小相等的菌絲塊，接種于淀粉酵母固體培養基（15 cm 培養皿）的中央，26℃ 倒置培養，并于接種后的3 d、5 d、7 d、9 d 測量菌落直徑，第9 天對菌落進行拍照。每個樣品重復3 皿，進行3 次獨立實驗，對數據進行單因素方差分析。

1.2.3Mohmt1敲除突變體產孢量的統計及形態觀察 將野生型及突變體相關菌株接種到米糠培養基上直至菌絲長滿培養皿（9 cm），然后刮去表面的氣生菌絲，26℃ 開蓋光照產孢2 d，用無菌水沖洗收集所有孢子。將孢子懸浮液于三層濾紙過濾后，用血球計數板對孢子數量進行統計。每個樣品重復3皿，進行3 次獨立實驗，對數據進行單因素方差分析。

1.2.4Mohmt1敲除突變體孢子的萌發實驗 將上述獲得的野生型及突變體菌株的孢子懸浮液定容至濃度為1×104- 2×104個/mL，吸取12 μL 滴至Gelbond film 疏水表面上，26℃ 保濕培養，并于培養1 h、2 h、4 h、8 h、12 h 后統計孢子的萌發率。每個樣品重復5 滴，在觀察時間段每滴觀察3 個視野，并進行3 次獨立實驗，對數據進行單因素方差分析。

表1 本研究所用的引物序列

1.2.5Mohmt1敲除突變體洋蔥表皮侵染實驗 撕取約 4 mm×4 mm 大小的洋蔥表皮第3 層（從外到內）內表皮，置于每孔含有2 mL 蒸餾水的24 孔培養板孔洞內。調整野生型及突變體菌株的孢子懸浮液的濃度至4×104個/mL，吸取10 μL 孢子懸浮液滴至洋蔥表皮上，26℃ 培養，分別于培養24 h 和48 h后觀察侵染情況。

1.2.6Mohmt1敲除突變體活體接種實驗 調整野生型及突變體菌株的孢子懸浮液濃度為1×105個/mL（含 0.02% Tween），噴霧接種于水稻品種CO39（三葉期）上，于溫室內黑暗保濕處理24 h 后光照培養5 d，觀察葉片的致病情況，其中葉瘟分級的具體分級標準參考 Valent 等［31］的方法。本實驗獨立重復3 次。

2 結果

2.1 稻瘟病菌MoHmt1敲除突變體的篩選與鑒定

為了明確MoHMT1基因的生物學功能，本研究根據同源重組的原理對MoHMT1基因進行敲除，利用潮霉素磷酸轉移酶基因（HPH）重組替換MoHMT1基因完整的ORF 片段，并將潮霉素作為篩選標記獲得若干候選轉化子。首先利用PCR 技術對候選的轉化子進行DNA 水平驗證，如圖1-A 所示，凡是ORF（表1MoHMT1OF/R）無陽性擴增（約632 bp）且UAH（表1MoHMT1UAF/R）有陽性擴增（約1 450 bp）的轉化子即為Mohmt1敲除突變體菌株，本研究將其命名為ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19，而ORF 有陽性擴增而UAH 無陽性擴增的轉化子即為異位整合突變體，命名為Mohmt1-Ect。

其次，為了確認敲除突變體的可靠性，本研究進一步通過RT-PCR 技術對獲得的兩個敲除突變體和異位整合突變體進行了驗證。結果如圖1-B 所示，在ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19兩個敲除突變體中，幾乎檢測不到MoHMT1的表達；而陽性對照和異位整合突變體中檢測到MoHMT1的表達。

2.2 MoHMT1基因的缺失導致稻瘟病菌菌絲體生長明顯減慢

圖1 Mohmt1 敲除突變體的篩選鑒定

為了明確MoHMT1基因在稻瘟病菌營養生長過程中的作用，本研究對Mohmt1相關突變體進行了分析。結果如圖2 所示，在淀粉酵母培養基上，與野生型菌株Ku80 相比，ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19突變體菌落明顯變小（圖2-A），生長速率明顯減慢（圖2-B），且表面的氣生菌絲量明顯減少變薄（圖2-C），而Mohmt1-Ect 則與野生型相比無明顯變化。

圖2 Mohmt1 敲除突變體的菌落形態和生長速率

2.3 MoHMT1基因的缺失導致稻瘟病菌產孢明顯減少但不影響孢子的萌發

本研究繼而對Mohmt1相關突變體的產孢量和孢子萌發率進行了統計分析。結果如圖3-A 所示， 與 野 生 型 菌 株Ku80 相 比，ΔMoHmt1-14和ΔMoHmt1-19的產孢量明顯減少，僅為野生型的20%左右，暗示了ΔMoHmt1-14和ΔMoHmt1-19突變體在產孢量方面存在明顯缺陷。然而，盡管產孢量顯著下降，但是在4 h 時孢子萌發率幾乎達到100%，接近野生型的水平（圖3-B），說明突變體的孢子能進行正常地萌發。MoHmt1-Ect則在產孢量和孢子萌發率方面與野生型相比無明顯變化。

圖3 Mohmt1 敲除突變體的產孢量和萌發率統計

2.4 MoHMT1基因的缺失導致對稻瘟病菌的致病性明顯減弱

為了明確MoHmt1缺失突變體在稻瘟病菌侵染過程中發揮的作用，本研究首先進行了洋蔥表皮侵染實驗。結果如圖4-A 所示，在接種到洋蔥表皮48 h 后，與野生型和異位整合突變體相比，盡管Mohmt1缺失突變體產生的次生菌絲略微減少，但是能成功擴展侵入到鄰近的細胞中，暗示了Mohmt1缺失突變體在疏水表面能夠進行正常的侵染和擴展。

進一步將Mohmt1相關突變體的孢子懸浮液噴霧接種到水稻葉片上觀察其致病性，結果如圖4-B所示，野生型和異位整合突變體形成的病斑幾乎連接成片，且葉片枯黃，多為4-5 級病斑，而Mohmt1缺失突變體僅僅形成零星的褐色針眼狀病斑，病斑數目明顯減少，多為1 級病斑，偶爾見2 級病斑，表明稻瘟病菌Mohmt1缺失突變體對水稻的致病性明顯減弱。上述實驗表明，MoHMT1基因缺失后盡管孢子能夠正常侵入到水稻葉片并進行擴展，但是其對稻瘟病菌的致病性卻明顯減弱，暗示MoHMT1基因可能在稻瘟病菌的致病過程中發揮了重要的作用。

圖4 Mohmt1 敲除突變體的洋蔥表皮和水稻葉片侵染

3 討論

精氨酸的甲基化是真核生物中普遍存在的蛋白質翻譯后修飾，其作為轉錄表觀調控因子在premRNA 剪接、DNA 修復、mRNA 轉錄、細胞信號等過程扮演了重要的角色［3］，該修飾過程受到PRMTs的調控。研究表明該家族中最保守的成員PRMT1，在不同絲狀真菌中的功能既有保守性又有特異性，例如，禾谷鐮刀菌（F. graminearum）和黃曲霉（A.flavus）中AMT1/RmtA 參與真菌的生長發育和侵染致病過程，并調控著毒素和其他未知代謝物的產生［25，28］。而構巢曲霉（A. nidulans）中的RmtA 卻并不是真菌生長發育和侵染致病所必需的［27］，這與釀酒酵母（S. cerevisiae）和白色念珠菌（C. albicans）的研究結果一致［17，24］。另外，禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中RmtA基因缺失后對氧脅迫超級敏感［25］，而黃曲霉（A. flavus）中RmtA基因缺失后則增強了對氧脅迫的耐受力［28］。這些研究結果為研究稻瘟病菌中MoHmt1（PRMT1 的同源蛋白）的功能指明了方向。

鑒于此，本研究根據同源重組的原理獲得Mohmt1缺失突變體，并對相關突變體進行表型分析，結果發現MoHMT1缺失后減慢了菌絲生長發育減慢、孢子量降低、對水稻葉片的致病性減弱，然而其具體的調控機制尚未明確，其功能的發揮是否與其催化活性密切相關有待于進一步地研究。

在 釀 酒 酵 母（S. cerevisiae）中，Hmt1p 能 夠甲基化Hrp1/Nab2/Npl3 等底物蛋白，從而促進其從細胞核中運輸出來［18-19，32］，而禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中AMT1僅僅是核運輸FgHrp1 而不是FgNab2 所必需的［25］，暗示了甲基化作用位點在不同的真菌中存在差異。因此稻瘟病中MoHmt1 的底物蛋白及其作用位點有哪些，也有待于今后進一步研究。

4 結論

從稻瘟病菌（M. oryzae）中鑒定出PRMT1 的同源蛋白MoHmt1，根據同源重組的原理獲得Mohmt1缺失突變體，對其進行生物學功能分析發現，與野生型相比，Mohmt1缺失突變體的菌落明顯變小，生長速率明顯減慢，且表面的氣生菌絲量明顯減少變薄；MoHMT1的缺失也導致產孢量明顯下降，僅為野生型的20%左右，但是這些孢子能夠正常萌發形成附著胞，并能在洋蔥表皮細胞中成功地定殖和擴展；進一步對水稻葉片進行接種發現，Mohmt1缺失突變體的病斑數量明顯少于野生型，病情指數下降，致病性減弱。綜上所述，MoHmt1 蛋白可能在稻瘟病菌的生長發育和致病過程中發揮了重要的作用。