產甲殼素酶菌株的篩選、鑒定及其酶解產物分析

徐田甜，陳 彬，侯是媛，曹 丹，許晨磊，齊 斌，鄭麗雪，王立梅,,*

（1.蘇州大學醫學部藥學院，江蘇 蘇州 215123；2.常熟理工學院發酵工程技術研究中心，江蘇 常熟 215500）

甲殼素又名幾丁質，是由β-(1,4)糖苷鍵連接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖高分子多聚體，廣泛存在于自然界中，儲量僅次于纖維素[1-2]。甲殼素不溶于水，在甲殼素酶的作用下可分解成水溶性甲殼低聚糖或殼寡糖。甲殼素低聚糖具有抑菌、抗氧化、促進動植物生長發育等多種功能[3-6]。Ouyang Qianqian等[7]研究發現神經炎癥和氧化應激可能導致阿爾茨海默病，而殼聚糖、殼寡糖具有顯著的抗神經炎癥以及抗氧化作用，未來可能廣泛應用于阿爾茨海默病的治療。Xu Qingsong等[8]研究發現殼寡糖具有顯著的抗腫瘤活性，由殼寡糖制備成的高度N-乙酰化殼寡糖能顯著抑制脂多糖誘導的促炎細胞因子白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α表達。另外甲殼素的分解產物在食品和農業上具有廣泛的應用前景[9]。

甲殼素酶主要產自微生物，包括芽孢桿菌、鏈霉菌、黏質沙雷氏菌以及假單胞菌等[10-13]。近年來，研究者通過隨機誘變、定點誘變以及改變篩選策略等方法獲得高產或具有特殊性質的甲殼素酶菌株，如耐冷、耐熱以及耐酸堿甲殼素酶等[14-17]。麻蝦醬是由產自海洋的麻線蝦加鹽，經過自然發酵制得的富含蛋白質、甲殼素的調味料，是我國及東南亞地區常見的傳統食品[18-20]。傳統麻蝦醬中微生物多樣性和構成非常復雜[21]，適合用作產甲殼素酶菌株的篩選，目前還鮮見從麻蝦醬中篩選產甲殼素酶菌株的報道。

本實驗以麻蝦醬為原料，篩選高產甲殼素酶的微生物菌株，通過酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測定其甲殼素酶活，并利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）聯用技術對該菌株發酵液中成分進行檢測，以期篩選到高產甲殼素酶的菌株，為工業化生產殼寡糖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻蝦醬 連云港市海娃食品有限公司；甲殼素與細菌DNA基因組提取盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲殼素酶ELISA檢測試劑盒 武漢純度生物科技有限公司；Chitosan標準品 日本Seikagaku公司；其他試劑均為市售分析純。

初篩培養基[22]：A液：K2H P O41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCI 10 g/L、(NH4)2SO420 g/L、瓊脂40 g/L，去離子水1 000 mL，pH 6.5；B液：10 g/L 膠體甲殼素。使用前等體積混合。

復篩培養基[22]：A液：K2H P O41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCl 10 g/L、(NH4)2SO420 g/L，去離子水1 000 mL，pH 6.5；B液：10 g/L 膠體甲殼素，pH 6.5。使用前等體積混合。

種子培養基：PDA。

膠體甲殼素的制備方法參照文獻[23]：將片狀甲殼素粉碎過篩，稱取10 g粉末甲殼素緩緩加入濃鹽酸200 mL，迅速攪拌，待其全部溶解后用玻璃棉過濾除去雜質，溶液加入1 000 mL蒸餾水。離心得到沉淀，用蒸餾水洗至中性。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-ZF超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；HZQ-F280恒溫振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠；XS105DU電子天平、DYY-6C pH計 瑞士Mettler Toledo公司；legend micro 17R臺式高速冷凍離心機、NanoDrop 2000核酸濃度測定儀 德國Thermo公司；WGL-230B電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；My Cycler PCR基因擴增儀、DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳槽、Gel Doc XR凝膠成像系統、酶標儀 美國Bio-Rad公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；MILI-QADVANT超純水儀 美國Millipore公司；3-30K高速臺式離心機 美國Sigma公司；UPLCQ-TOF-MS儀 美國Waters公司；ZEISS SIGMA熱場發射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 初篩

稱取25 g蝦醬與225 mL生理鹽水制備菌懸液，同時將其質量濃度稀釋至10-1、10-2、10-3g/mL和10-4g/mL。將原液和上述稀釋的菌液涂布于初篩培養基上，37 ℃生長1～7 d后挑取生長良好的單一菌落在初篩培養基上劃線分離。

1.3.2 復篩

挑取初篩培養基上生產的周圍有明顯透明圈的單一菌落接種到液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養1～7 d。

1.3.3 ELISA法酶活測定

將發酵液3 000 r/min離心10 min，取上清液為待測樣品。往預先包被甲殼素酶抗體的包被微孔中，依次加入待測樣品、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的檢測抗體，經過37 ℃溫育1 h并徹底洗滌。用底物3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺顯色，在HRP催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化為最終的黃色。用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，通過標準曲線計算樣品活性。標準品為純甲殼素酶配制的酶活性為0、1.5、3、6、12、24 U/L酶溶液。酶活定義為：37 ℃條件下，每毫克蛋白每小時分解甲殼素產生1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位U。具體操作步驟參考說明書。

1.3.4 菌種鑒定

1.3.4.1 形態學鑒定

平板劃線、革蘭氏染色和電鏡觀察法觀察菌落和菌體形態。參照文獻[24]，采用簡便快速的插片法制樣，直接噴金后進行掃描電鏡觀察。

1.3.4.2 生理生化鑒定

根據文獻[25-27]進行生理生化鑒定。

1.3.4.3 分子生物學鑒定

以16S rDNA細菌通用引物擴增，將擴增片段送至生工生物工程（上海）股份有限測序，將測序得到的基因序列在NCBI上進行BLAST比對，利用軟件MEGA5.1構建N-J系統進化樹。

1.3.5 發酵液可溶性糖成分分析

1.3.5.1 Chitosan標準品溶液配制

稱取標準品殼二糖3.8 mg、殼三糖4.9 mg、殼四糖4.3 mg、殼五糖7.0 mg和殼六糖7.0 mg溶于10 mL容量瓶中。

1.3.5.2 UPLC條件

采用BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）柱，柱溫45 ℃，進樣量2 μL。流動相A：體積分數80%乙腈和體積分數0.1%氨水，流動相B：體積分數30%乙腈和體積分數0.1%氨水。流動相梯度稀釋見表1。

表1 流動相梯度稀釋Table 1 Mobile phase gradient elution program

1.3.5.3 質譜條件

采用電噴霧電離源，在正離子電離模式下進行質譜分析。毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓20 V。離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑流速700 L/h，錐孔反吹氣流量50 L/h，碰撞室能量6 V，四極桿掃描范圍m/z200～2 000。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

圖1 X1菌株形態學鑒定圖Fig. 1 Morphological identification of strain X1

經過初篩復篩后，篩選到1 株X1菌株。由圖1可見，30 ℃培養5～7 d后，X1菌株在以甲殼素為唯一碳源的初篩培養基上長出透明圈（圖1A）。菌落呈圓型，干燥，粗糙，凸起，粉末狀，較易挑起，無色素，有明顯的土霉氣味。挑取菌落，經革蘭氏染色后顯微鏡觀察（圖1B），該菌為革蘭氏陽性菌。由1C、D電鏡觀察圖可知，X1菌株孢子表面光滑，為卵圓形，孢子鏈為直行或卷曲。

2.2 生理生化鑒定

2.2.1 生理生化實驗結果

表2 X1菌株的生理生化實驗Table 2 Physiological and biochemical properties of strain X1

由表2可見，該菌具有纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、過氧化氫酶活性，同時能使牛奶緩慢胨化，其VP、MR實驗結果為陰性。X1菌株在30 ℃、pH 6.5條件下生長良好。

2.2.2 碳源利用實驗結果

表3 X1菌株碳源利用實驗Table 3 Carbon source utilization ability of strain X1

由表3可見，除木糖、果糖和山梨糖外，該菌可利用其他10 種碳源，其可分解甲殼素、殼聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖，可初步推斷該菌所產甲殼素酶為酶系，可能包含甲殼素酶、甲殼素脫乙酰酶、殼聚糖酶等。

2.3 分子生物學鑒定

2.3.1 PCR擴增產物電泳圖

圖2 PCR擴增產物電泳圖Fig. 2 Electrophoretogram of PCR amplification products

由圖2可知，以X1菌株DNA為模板，利用細菌通用引物菌株的16S rDNA基因，將PCR產物進行質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳，獲得1 500 bp左右擴增片段，并將1 500 bp左右的條帶切膠回收后送sanger法測序。

2.3.2 系統進化發育樹

圖3 X1菌株系統進化發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain X1

經NCBI上BLAST比對后，系統進化樹（圖3）顯示該菌可確定為鏈霉菌屬，且與淀粉酶鏈霉菌同源性較高，高達99%以上。結合菌落的特征、形態學、生理生化實驗和16S rDNA基因序列分析，可確認本實驗所篩選到的菌株屬于淀粉酶鏈霉菌亞種，命名為S. diastaticus strain CS 1801。在最適條件（30 ℃、pH 6.5）培養7 d后，發酵液中甲殼素酶活力可達117.4 U/L。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS分析

2.4.1 UPLC分析

圖4 標準品（A）與發酵液（B）UPLC圖Fig. 4 Ultra-high performance liquid chromatograms of standard (A)and fermentation broth (B)

由圖4A可知，殼寡糖標準溶液具有殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖5 種不同分子質量的寡糖成分，在5.09、6.82、8.29、9.59、10.60 min分別出現吸收峰，對應的應為分子質量由小到大的殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。

由圖4B可知，發酵7 d后的發酵液樣品，在5.15、6.78、8.29、9.56、10.58 min出現吸收峰，與標準品的出峰時間基本一致，由此發酵液中很有可能含有殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。

2.4.2 質譜分析

圖5 標準品與發酵液質譜分析Fig. 5 Mass spectra of standard and fermentation broth

由圖5A可知，殼寡糖標準品UPLC 5 個峰對應的質譜主要分子離子峰為m/z 341.2、502.2、663.3、824.4、985.5，其m/z值依次相差約161，這與氨基葡萄糖的殘基吻合，其依次屬于殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖的[M＋H]＋峰[28-31]。由圖5B可見，發酵液的UPLC的5 個峰對應的主要分子離子峰也為m/z 341.2、502.3、663.4、824.5、985.6。這與殼寡糖標準品的質譜圖結果高度一致。

結合UPLC-Q-TOF-MS結果可以判定，甲殼素酶發酵液中含有5 種不同聚合度的殼寡糖，分別為殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。

3 結 論

本實驗以甲殼素為唯一碳源從麻蝦醬中篩選到1 株產甲殼素酶的菌株，經鑒定為淀粉酶鏈霉菌，除甲殼素酶外還產脂肪酶、淀粉酶等多種工業酶，同時實驗還研究了發酵液中可溶性糖的成分。本實驗得出兩個結論：1）篩選到1 株產甲殼素酶的菌株，鑒定后為淀粉酶鏈霉菌，復篩培養基發酵7 d后酶活力為117.4 U/L。2）經技術檢測證實，發酵液中產殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。發酵液中5 種糖分子質量分別為 341.2、502.3、663.4、824.5、985.6 Da，與標準品高度吻合。

目前，殼寡糖因其抑菌、抗腫瘤、降血脂等生物活性已被廣泛應用于食品、生物醫學和制藥領域。與甲殼素和殼聚糖不同，殼寡糖具有良好的溶解性[32-34]。因此，低聚合度的殼寡糖的生產越來越受到人們的重視。而我國目前對酶法發酵產低聚合度殼寡糖的研究還相對較少，因此本研究為酶法工業化產低聚合度的殼寡糖提供了良好的參考依據，將大大推動其工業化發展進程。