阿魏酸對糞腸球菌和屎腸球菌產酪胺機制的影響

薛林林，王 遠，李彬彬，王慶玲，盧士玲,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；2.新疆農墾科學院，新疆 石河子 832000）

酪胺是一種生物胺，廣泛存在于奶酪、酒和發酵肉制品等食品中[1-3]。適量的酪胺對人體的某些生理機能具有調節作用，而攝入過量便會引起偏頭痛、高血壓以及腦出血等嚴重問題[4-6]。腸球菌被認為是酪胺的主要產生菌。Ladero等[7]研究發現，無論是存在于動物、人體或是食品原料中的腸球菌都可以通過酪氨酸脫羧（tyrosine decarboxylase，TDC）途徑將酪氨酸轉化為酪胺。大量研究表明，在腸球菌TDC基因簇中編碼氨基酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase，tyrDC）和酪氨酸/酪胺透性酶（tyrosine/tyramine permease，tyrP）的基因通常是相鄰的，還具有酪氨酰-tRNA合成酶（tyrosyltRNA synthetase，tyrS）基因以及編碼Na＋/H＋轉運蛋白（Na＋/H＋antiporter，nhaC）的基因[1,8]。

酚類化合物是食用植物中最多樣化的次級代謝物之一，許多研究報道植物多酚提取物對不同的細菌活性具有抑制作用[9-11]。阿魏酸是酚類化合物的一種，存在于糧食、蔬菜、水果和堅果等原料中[12]。Chan等[10]證實阿魏酸可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌等致病菌的生長。Lemos等[13]也表明阿魏酸和水楊酸可以破壞蠟狀芽孢桿菌和熒光假單胞菌生物膜結構，起到抑制其生長的作用。魏延玲等[14]發現阿魏酸能顯著抑制風干鱸魚加工及貯藏過程中微生物的生長及生物胺的產生。而目前關于阿魏酸對腸球菌中酪胺產生影響以及產酪胺途徑中相關基因表達的研究鮮見報道。

本實驗旨在利用阿魏酸對熏馬腸中高產酪胺的糞腸球菌和屎腸球菌產酪胺作用效果，并從分子生物學角度研究阿魏酸對腸球菌產酪胺TDC基因簇相關基因表達水平的影響，明確了阿魏酸影響腸球菌產酪胺的機制，為將阿魏酸應用于發酵食品中以提高其安全性提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌XL-M76（Enterococcus faeciumXLM76），GenBank登錄號為MK201640；糞腸球菌XL-M66（E. faecalisXL-M66），GenBank登錄號為MK201639，由本實驗室從熏馬腸中分離保存并送往華大基因測序鑒定。

阿魏酸（≥98%）、酪氨酸 北京博奧拓達科技有限公司；M17肉湯 青島高科園海博生物技術有限公司；酪胺標準品（≥99%）、甲醇、乙腈（均為色譜純）美國Sigma公司；Trizol試劑 美國Invitrogen公司；5×All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit) cDNA合成試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix-No Dye 加拿大ABM公司。

1.2 儀器與設備

ND2000C型微量核酸測定儀 基因有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；5417R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；多功能酶標儀 美國BioTek儀器有限公司；LightCycler?480型熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；ACQUITY Arc System高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；SPX-150B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試菌菌懸液的制備

將本實驗室從熏馬腸中分離的腸球菌菌株（-18 ℃甘油保藏）接種于M17肉湯培養基（pH 5.5）中，37 ℃培養24 h，活化3 次，以用于后續實驗。

1.3.2 阿魏酸對供試菌生長的作用

準備一批10 mL M17肉湯培養基，分為4 組，第1組為空白對照組，不添加酪氨酸和阿魏酸；第2組僅添加0.071%阿魏酸；第3組僅添加0.2%酪氨酸；第4組同時添加0.071%阿魏酸和0.2%酪氨酸。每組均含不添加供試菌株的陰性對照。接入200 μL供試菌株于37 ℃恒溫培養，在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h取樣，用多功能酶標儀測菌懸液OD600nm值，并測量pH值，每組樣品各做3 個平行。

1.3.3 TDC基因簇相關基因表達量的測定

1.3.3.1 RNA的提取及cDNA的合成

取1.3.2節中生長至穩定期的各組菌懸液2.0 mL，于4 ℃、10 000 r/min離心3 min得菌體沉淀后，采用Trizol法提取細菌總RNA。提取完成后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并使用微量核酸定量儀測定各組總RNA濃度及其OD260nm/OD280nm值。待RNA完整性、濃度以及純度達到要求后使用去除gDNA污染的cDNA合成試劑盒進行cDNA的合成。20 μL體系加入2 μg總RNA。

1.3.3.2 RT-qPCR基因表達

表1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

向無酶八連管中加入10.0 μL的EvaGreen 2×qPCR MasterMix，2 μL的cDNA模板，上下引物各0.6 μL，加入無酶水補足至20 μL，輕微離心將反應液混勻，用于反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）體系上機檢測。擴增程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，40 個循環。每組樣品（包括陰性空白對照）做3 個平行。采用2-ΔΔCt計算方法[15]計算TDC基因簇基因的相對表達量。

1.3.4 HPLC法測定菌懸液中酪胺質量濃度變化

1.3.4.1 酪胺標準溶液的配制

準確稱量10 mg酪胺標準品，用0.4 mol/L的高氯酸溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，分別稀釋成終質量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/mL的標準溶液。

1.3.4.2 樣品的制備

取1.3.2節中供試菌菌懸液，于0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h取樣，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集無細胞上清液。

1.3.4.3 衍生化

吸取標準品溶液和無細胞上清液樣品各1 mL，置于5 mL棕色容量瓶中，按照Lu Shiling等[19]的方法進行衍生化。衍生后樣品經0.22 μm濾膜過濾到樣品瓶中，用于上機檢測。每組樣品做3 個平行。

1.3.4.4 HPLC條件

色譜柱為Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為超純水，流動相B為乙腈，色譜柱流速0.8 mL/min，紫外檢測波長254 nm，進樣體積10 μL，柱溫30 ℃，洗脫過程如表2所示。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.4 數據分析

所有實驗數據使用Microsoft Excel 2016建立數據庫，采用Origin 2018b繪圖，并用SPSS 25做顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 阿魏酸對屎腸球菌和糞腸球菌生長的影響

如圖1所示，未添加阿魏酸的空白對照組細菌OD600nm值始終高于添加阿魏酸組，說明阿魏酸有效抑制了糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的生長，使最終菌體數量減少，但阿魏酸并沒有改變2 株菌的生長趨勢，只是延長了其對數生長期。這與先前報道的阿魏酸對其他菌的抑制效果類似[20-21]。這是由于阿魏酸可以引起細菌細胞膜表面負電荷和疏水性改變，細胞膜局部破裂或形成孔洞導致細胞內溶物外泄，從而達到良好的抑菌效果[13,22]。而添加酪氨酸對2 株腸球菌的生長沒有明顯的影響（P＞0.05）。這與Bargossi等[23]研究得出酪氨酸可以加快糞腸球菌生長速度的結果不同，這可能是因為其在菌株活化階段分別接種于含或不含酪氨酸的培養基中，菌株已經進行酪氨酸的預適應，而本實驗中供試菌均在不含酪氨酸的培養基中活化，菌株利用酪氨酸生長代謝較為緩慢。此外，由圖1可以看出，糞腸球菌XL-M66阿魏酸組最終OD600nm值較空白組降低了0.69，屎腸球菌XL-M76僅降低0.39；圖2中也發現糞腸球菌XL-M66阿魏酸組pH值下降趨于平緩，最終與空白組相差0.53，而屎腸球菌XL-M76 pH值下降較為迅速，僅相差0.30。綜合OD600nm值和pH值可以看出，糞腸球菌XL-M66對阿魏酸的敏感性更強。

圖1 阿魏酸對糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）生長抑制作用Fig. 1 Effect of ferulic acid on the growth of E. faecalis XL-M66 (A)and E. faecium XL-M76 (B)

圖2 阿魏酸對糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）48 h生長過程中pH 值的變化Fig. 2 Effect of ferulic acid on pH changes during growth of E. faecalis XL-M66 (A) and E. faecium XL-M76 (B)

如圖2所示，空白組培養液的pH值均在4 h后迅速下降，20 h后趨于平穩，最終pH值穩定在4.1左右。說明2 株供試菌對數期均有較強的產酸能力，進入穩定期之后，菌落數達到最大，培養基中能量被迅速消耗，代謝廢物增多，菌落活性減弱，pH值下降也隨之減慢。添加酪氨酸組的pH值始終高于空白組，且在菌株生長初期，培養液pH值有微弱上升。這是由于酪氨酸是合成酪胺的必要物質，隨著供試菌株的生長繁殖，培養基中酪胺的質量濃度在不斷積累，而酪胺屬于一類堿性物質，可以中和培養液中產生的酸性物質，且在生長初期，酪胺的產生速度略高于酸性物質的產生速度。Fernández等[24]也證實在酪氨酸存在的情況下，產酪胺的堅忍腸球菌能夠引起培養基pH值增加，而不產酪胺的突變體pH值則沒有變化。添加阿魏酸組的曲線較為平穩且趨于穩定后pH值要高于空白組，表明阿魏酸對2 株供試菌的生長具有一定程度的抑制作用。

2.2 阿魏酸對供試菌株基因表達分析

腸球菌TDC基因簇中tyrDC、tyrP、tyrS和nhaC四種基因共同調節酪胺的生物合成，其中tyrDC負責酪胺的合成，tyrP則負責胞內胞外酪氨酸-酪胺的交換[25-26]。通過RT-qPCR可以具體檢測TDC基因簇中4 種基因的表達情況。2 株腸球菌在不同條件下4 種基因的相對表達量如圖3所示。

由圖3可知，2 株菌添加酪氨酸組tyrDC、tyrP和nhaC的3 個基因在轉錄水平上均顯著上調（P＜0.05），其中糞腸球菌XL-M66酪氨酸組3 種基因表達水平分別達到空白組的30.1、40.0 倍和9.7 倍，屎腸球菌XL-M76為22.8、15.3 倍和47.8 倍。這是因為在酸性條件下，酪氨酸為細胞堿化脫羧反應提供了前體物質，誘導tyrDC和tyrP基因的表達進而合成酪胺抵抗胞外酸性環境[23,27]。雖然nhaC基因參與酪胺合成的具體功能作用還未可知，但可以確定的是酪氨酸可以促進nhaC基因的表達。而tyrS基因的表達量隨酪氨酸的添加顯著減少（P＜0.05），其中糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76空白組基因表達量分別是酪氨酸組的11.9 倍和17.9 倍。Coton[28]和Linares[29]等研究發現糞腸球菌中tyrDC基因表達量與酪氨酸濃度呈正相關，而在缺乏酪氨酸情況下，tyrS基因被最大化轉錄，這與本實驗研究結果一致。說明tyrS基因可能是作為TDC基因簇遺傳調控的負調節系統，用來防止酪氨酸的大量脫羧，確保有可用的酪氨酸用于細胞生長和蛋白質合成。與空白組相比，添加阿魏酸促進了tyrS基因的表達，這可能是因為阿魏酸降低了腸球菌菌株活性，使之利用培養基中營養物質合成酪氨酸能力降低，培養液中游離的酪氨酸質量濃度減少，所以tyrS基因轉錄增多，促使酪氨酸合成相應的蛋白質。而與酪氨酸組相比，添加阿魏酸對2 株供試菌的tyrS基因表達均無顯著影響（P＞0.05）。

圖3 阿魏酸對糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）TDC相關基因表達量影響Fig. 3 Effect of ferulic acid on the expression of tyramine synthesisrelated genes in E. faecalis XL-M66 (A) and E. faecium XL-M76 (B)

在酪氨酸存在情況下，添加阿魏酸可顯著降低2 株腸球菌tyrDC、tyrP基因的表達（P＜0.05），糞腸球菌XL-M66酪氨酸組tyrDC和tyrP基因表達量為酪氨酸＋阿魏酸組的7.6 倍和10.3 倍，而屎腸球菌XL-M76僅為5.4 倍和5.8 倍。表明阿魏酸對糞腸球菌XL-M66 tyrDC和tyrP基因轉錄影響要大于屎腸球菌XL-M76。而阿魏酸影響tyrDC和tyrP基因的轉錄，可能是影響了酪氨酸脫羧酶以及轉運蛋白的活性，使之對酪氨酸的感應能力降低，從而使相關基因表達量降低。Kang等[30]研究表明煙酸可以顯著抑制屎腸球菌酪氨酸脫羧酶的活性和tyrDC基因的表達。此外，阿魏酸組與空白組的tyrDC和tyrP基因表達量無顯著性差異，這表明只有在TDC途徑被誘導激活情況下，阿魏酸才會對tyrDC和tyrP基因起到抑制作用，進一步說明，阿魏酸是通過影響酪氨酸脫羧酶和轉運蛋白的活性控制相關基因的轉錄，從而減少酪胺的產生。由圖3B發現，阿魏酸顯著降低nhaC基因的表達（P＜0.05），其中酪氨酸組的nhaC基因表達量達到酪氨酸＋阿魏酸組的5.0 倍，而圖3A中，阿魏酸對糞腸球菌XL-M66 nhaC基因表達沒有顯著作用（P＞0.05）。

一些研究發現pH值是影響TDC基因簇表達的重要因素，相對較低的pH值更有利于TDC基因的誘導表達，且酪氨酸脫羧酶活性更高[18]。在酸性pH值和高濃度酪氨酸存在情況下，tyrDC和tyrP共同編碼的tyrDC-tyrP多順反子信使被誘導激活，從而激活tyrDC和tyrP基因的表達[27]。圖3A中糞腸球菌XL-M66酪氨酸組tyrDC和tyrP基因表達量是酪氨酸＋阿魏酸組的7.6 倍和10.3 倍，而圖2A中酪胺酸組pH值始終高于酪氨酸＋阿魏酸組，最終pH差值在0.3左右。圖3B中，屎腸球菌XL-M76酪氨酸組tyrDC和tyrP基因表達量均達到了酪氨酸＋阿魏酸組5 倍以上，相同的是圖2B中酪氨酸組的pH值也處于較高水平，兩組pH差值為0.2左右。這說明添加阿魏酸不僅直接抑制tyrDC和tyrP基因表達，也通過調控pH值的升高間接影響tyrDC和tyrP基因的轉錄表達。黃笠原等[31]在大蒜精油對德氏乳桿菌產腐胺機制影響研究中也表述了相同的結果。

2.3 阿魏酸對供試菌株產酪胺能力分析

圖4 阿魏酸對糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）培養48 h酪胺積累的影響Fig. 4 Effects of ferulic acid on accumulation of tyramine in E. faecalis XL-M66 (A) and E. faecium XL-M76 (B)

如圖4所示，在僅添加酪氨酸情況下，糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76在4～16 h均快速產生大量酪胺，20 h后酪胺產生速率明顯減慢，質量濃度趨于穩定，最終分別達到227.0 μg/mL和216.6 μg/mL。這是因為細菌對數生長期代謝能力最強，能夠充分利用底物合成酪胺，而到達穩定期后，由于培養基中前體物質酪氨酸被大量消耗，質量濃度降低，且酪氨酸脫羧酶的活性降低，所以酪胺的產生速率也隨之減慢。由空白組可以看出，糞腸球菌XL-M66在12 h內未檢出酪胺，屎腸球菌XL-M76在16 h未檢出酪胺，48 h時2 株腸球菌酪胺質量濃度分別為36.6 μg/mL和26.9 μg/mL。這是由于菌株在自身生長代謝過程中會利用外界營養成分合成相應的氨基酸，但因為生長初期培養液中菌落總數少，合成的氨基酸濃度較低，無法誘導tyrDC基因的表達[27]。

由酪氨酸＋阿魏酸組也可以看出，糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的產酪胺能力隨著阿魏酸的添加均顯著降低（P＜0.05），較酪氨酸組酪胺質量濃度分別減少了27.0%和19.9%。趙利利等[20]研究也發現阿魏酸可以使大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌產組胺質量濃度降低18.45%和25.78%，這與本實驗結果類似。阿魏酸不僅能夠抑制腸球菌的生長，還會抑制操縱子tyrDC和tyrP轉錄，使酪氨酸脫羧酶質量濃度降低，從而有效減少腸球菌酪胺的積累。

3 結 論

阿魏酸對糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76均具有顯著的抑制作用（P＜0.05），且對糞腸球菌XL-M66的抑制效果要強于屎腸球菌XL-M76。在不含酪氨酸底物情況下，阿魏酸對tyrDC和tyrP基因影響不大（P＞0.05），但可以促進tyrS基因的表達；添加酪氨酸，使得整個酪胺合成TDC途徑被徹底激活，tyrDC和tyrP基因大量表達，此時添加阿魏酸能顯著抑制tyrDC、tyrP基因的表達（P＜0.05）。添加阿魏酸也能夠減慢2 株菌生長過程中pH值的下降，并且使得糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的酪胺產量分別降低27.0%和19.9%。因此，阿魏酸通過抑制糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的數量、控制pH值降低以及tyrDC和tyrP基因的表達抑制酪胺的產生。