表面活性劑在生物轉(zhuǎn)化法合成普魯蘭中的作用及生理機(jī)制

王大慧，巨曉敏，衛(wèi)功元*

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

普魯蘭是一種由麥芽三糖經(jīng)α-1,6-糖苷鍵聚合而成的微生物多糖，通常由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）合成并分泌到胞外[1]。作為一種化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的水溶性高分子物質(zhì)，普魯蘭具有良好的可塑性、成膜性和穩(wěn)定性，因而可以安全地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保和輕工等諸多領(lǐng)域[2-4]。2002年，普魯蘭被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為GRAS（Generally Regarded As Safe）的微生物多糖[5]。2006年5月19日，國家衛(wèi)生部發(fā)布第8號(hào)公告，將普魯蘭列為新增的4種食品添加劑之一。此后，普魯蘭在市場(chǎng)上的需求量日益增長(zhǎng)。

目前，普魯蘭的生物合成主要采用發(fā)酵法[1,6]。為提高普魯蘭的產(chǎn)量以及合成效率，科研人員分別從培養(yǎng)基設(shè)計(jì)、發(fā)酵條件控制、關(guān)鍵酶活性提升以及跨膜運(yùn)輸?shù)冉嵌葘?duì)普魯蘭的合成過程進(jìn)行研究，確定了一些關(guān)鍵的影響因素[7-9]。其中，表面活性劑的添加對(duì)于促進(jìn)普魯蘭的合成具有明顯的積極作用[10]。常天俊等[11]考察了吐溫40、吐溫60和吐溫80在普魯蘭發(fā)酵生產(chǎn)中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種表面活性劑均能促進(jìn)細(xì)胞分泌多糖，添加0.05%吐溫80時(shí)效果最好，不僅能提高約25%普魯蘭產(chǎn)量，而且還可以將發(fā)酵時(shí)間縮短近2 d。Sheng Long等[12-13]發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫80可以顯著提高普魯蘭的產(chǎn)量，認(rèn)為吐溫80加速了細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取，增加了葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，提高了細(xì)胞膜脂肪酸的含量，加速了普魯蘭向胞外分泌。Tu Guangwei等[14]在培養(yǎng)基中添加0.05%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫80，將聚蘋果酸和普魯蘭的產(chǎn)量分別提高了75.08%和27.21%，認(rèn)為吐溫80提高了氧氣攝取速率和CO2釋放速率，上調(diào)了相關(guān)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)因子的轉(zhuǎn)錄水平，最終提高了聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的產(chǎn)量。除此之外，鮮見其他表面活性劑影響普魯蘭生物合成的報(bào)道。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)普魯蘭還可以利用全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的方法合成得到[15]。在生物轉(zhuǎn)化過程中，普魯蘭合成代謝途徑中的3 個(gè)關(guān)鍵酶α-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（α-phosphoglucose mutase，PGM）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGP）和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，F(xiàn)KS），能量物質(zhì)ATP的供給與消耗速率，以及細(xì)胞膜的通透性都是決定普魯蘭能否高效合成的影響因素[16]。與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝過程的復(fù)雜性不同，增加微生物細(xì)胞膜通透性可以通過添加表面活性劑得以實(shí)現(xiàn)[17]。然而，表面活性劑對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭是否具有促進(jìn)作用以及其中蘊(yùn)含的生理生化機(jī)制至今不得而知。為此，本研究分析食品工業(yè)的非離子型表面活性劑斯潘和吐溫對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭的影響，并從細(xì)胞特性、關(guān)鍵酶活性、胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝等角度解析表面活性劑的作用機(jī)制，研究結(jié)果將為進(jìn)一步提高普魯蘭生物合成效率提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出芽短梗霉CCTCC M 2012259，由蘇州大學(xué)微生物生理與代謝調(diào)控研究室保藏。

種子培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基[15]：葡萄糖63.97 g/L，酵母粉3.57 g/L，(NH4)2SO40.6 g/L，NaCl 1.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.18 g/L，pH 6.5。

轉(zhuǎn)化液：葡萄糖50 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.8。

磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測(cè)試盒 上海皓塵生物科技有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測(cè)試盒 上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司；BIOTECH-5BGZ攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；HZ-2010K恒溫?fù)u瓶柜 太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；J6-MI型冷凍離心機(jī) 美國Beckeman公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 靜息細(xì)胞制備

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h獲得種子。按10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量將種子接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在30 ℃、400 r/min和通氣量3 L/min條件下培養(yǎng)36 h。將發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌2 次后制得靜息細(xì)胞。

1.3.2 生物轉(zhuǎn)化

將靜息細(xì)胞均勻懸浮于裝有50 mL轉(zhuǎn)化液的500 mL三角瓶中，置于30 ℃、200 r/min搖床中轉(zhuǎn)化24 h或48 h，初始菌體控制在10 g/L左右（按干細(xì)胞質(zhì)量計(jì)）。將無任何表面活性劑添加的生物轉(zhuǎn)化過程定義為空白對(duì)照。

1.3.3 細(xì)胞干質(zhì)量與普魯蘭產(chǎn)量測(cè)定

取20 mL轉(zhuǎn)化液（或發(fā)酵液），80 ℃水浴滅活15 min，冷卻至室溫后12 000 r/min離心10 min。細(xì)胞沉淀用蒸餾水洗滌3 次，離心后于70 ℃烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算得到細(xì)胞干質(zhì)量；取10 mL上清液，加入2 倍體積無水乙醇混勻，4 ℃處理12 h，12 000 r/min離心10 min，將沉淀于70 ℃烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算得到普魯蘭產(chǎn)量。

1.3.4 普魯蘭合成能力的計(jì)算

細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成普魯蘭能力的計(jì)算方法參見文獻(xiàn)[15]。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)24 h，取樣檢測(cè)普魯蘭質(zhì)量濃度。將1 g靜息細(xì)胞（干質(zhì)量）在1 h內(nèi)轉(zhuǎn)化葡萄糖合成的普魯蘭質(zhì)量定義為1 個(gè)普魯蘭合成能力，單位為mg/（g·h）。

1.3.5 細(xì)胞存活率的測(cè)定

分別取培養(yǎng)24 h和48 h的轉(zhuǎn)化液，用無菌水稀釋至10-5倍，取100 μL在含有PDA培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行涂布，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.6 無細(xì)胞提取物的制備

取5 mL轉(zhuǎn)化液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌2 次后，將濕細(xì)胞重新懸浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，超聲破碎10 min（破碎10 s，間隔10 s），4 ℃、12 000 r/min離心20 min，得到的上清液即為無細(xì)胞提取物，用于測(cè)定胞內(nèi)物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性。

1.3.7 酶活性測(cè)定

FKS活性測(cè)定方法參見文獻(xiàn)[18]。將0.2 mL含有10 mmol 4-硝基-α-D-吡啶葡萄糖苷的乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.0）與0.2 mL待測(cè)酶液快速混合均勻，在40 ℃水浴中反應(yīng)5 min，隨后加入3 mL甘氨酸-NaOH緩沖液（0.4 mol/L，pH 10.5）終止反應(yīng)。測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)生的4-硝基酚含量。一個(gè)FKS活性單位定義為每分鐘釋放1 μmol 4-硝基酚所需要的酶量。

PGM活性：采用磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定；UGP活性：采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定，操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.8 細(xì)胞膜通透性測(cè)定

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[19-20]。將離心收集的細(xì)胞重懸于0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，細(xì)胞密度控制在約106個(gè)/mL。將100 μL細(xì)胞懸浮物與1 μL 2.5 mg/L碘化丙啶（propidium iodide，PI）混合，37 ℃避光孵育50 min，加入900 μL磷酸緩沖溶液混勻。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)含有熒光探針的細(xì)胞數(shù)，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)625 nm。細(xì)胞流速為500 個(gè)/s，計(jì)數(shù)10 000 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算PI攝取率。

1.3.9 胞內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖測(cè)定

胞內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate g l u c o s e，U D P G）利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)[21]。Sigma-Aldrich Supelcosil LC-18-DB柱（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為40 mmol/L三乙胺-乙酸溶液（pH 6.0），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫22 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.10 胞內(nèi)ATP和ADP測(cè)定

利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)[21]。Waters 1525反相SunFire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.5），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 組平行樣品檢測(cè)結(jié)果的平均值。Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 斯潘對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭的影響

向轉(zhuǎn)化液中分別添加不同質(zhì)量濃度的斯潘20、斯潘40、斯潘60和斯潘80，研究斯潘在生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭中的作用。由圖1可以看出，在考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0～20 g/L），斯潘20對(duì)細(xì)胞的普魯蘭合成能力幾乎沒有影響。斯潘40和斯潘60的添加降低了細(xì)胞合成普魯蘭的能力，且添加質(zhì)量濃度越高，普魯蘭合成能力降低的幅度越大。斯潘80可以提高普魯蘭的合成能力，當(dāng)添加質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，普魯蘭的合成能力提高了46.5%。因此，在底物充足供給的前提下，斯潘80可以顯著提高普魯蘭的生物合成效率。

圖1 斯潘對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭的影響Fig. 1 Effect of Span on pullulan production

2.2 吐溫對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭的影響

圖2 吐溫對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成魯蘭的影響Fig. 2 Effect of Tween on pullulan production

向轉(zhuǎn)化液中添加不同質(zhì)量濃度的吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫80，研究吐溫在生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭中的作用，結(jié)果見圖2。與對(duì)照相比，吐溫20和吐溫40的添加降低了細(xì)胞的普魯蘭合成能力；吐溫60對(duì)生物轉(zhuǎn)化的影響不顯著；而吐溫80則顯著提高了細(xì)胞的普魯蘭合成能力。當(dāng)吐溫80質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，細(xì)胞合成普魯蘭的能力比對(duì)照提高了32.9%。同樣地，當(dāng)?shù)孜锕┙o充足時(shí)，吐溫80也可以明顯提高普魯蘭生物合成的效率。

2.3 斯潘80和吐溫80復(fù)配在生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭中的作用

斯潘80和吐溫80的分子結(jié)構(gòu)中都含有失水山梨醇單油酸酯，彼此的碳?xì)浞肿渔溨g能夠很好地相互吸引，二者復(fù)合使用時(shí)還可以增加體系的穩(wěn)定性[22]。為此，將20 g/L斯潘80和5 g/L吐溫80進(jìn)行復(fù)配，考察其在生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭中的作用。為便于比較，將斯潘80和吐溫80單獨(dú)添加后的普魯蘭產(chǎn)量（24 h和48 h）一并列出，結(jié)果見圖3。與空白對(duì)照相比，無論是單獨(dú)添加還是復(fù)配使用，斯潘80和吐溫80均提高了普魯蘭產(chǎn)量。斯潘80和吐溫80復(fù)配使用的效果最好，但是并未顯示出累加效應(yīng)。

圖3 斯潘80和吐溫80復(fù)配對(duì)生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭的影響Fig. 3 Separate and combined effect of Span 80 and Tween 80 on pullulan production

2.4 表面活性劑提高生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭效率的作用機(jī)制

2.4.1 細(xì)胞存活率

部分表面活性劑與微生物長(zhǎng)期接觸會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至?xí)芙饧?xì)胞膜的部分成分而實(shí)現(xiàn)殺菌作用[23]。為考察20 g/L斯潘80、5 g/L吐溫80及其復(fù)配對(duì)細(xì)胞存活率的影響，采用涂布平板的方法，對(duì)參與轉(zhuǎn)化反應(yīng)24 h和48 h后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。與生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)起始時(shí)的細(xì)胞總數(shù)（2.15×108個(gè)/mL）相比，單獨(dú)添加斯潘80時(shí)的活細(xì)胞數(shù)略有減少；單獨(dú)添加吐溫80以及復(fù)配對(duì)活細(xì)胞數(shù)影響不大。總體上，斯潘80和吐溫80對(duì)細(xì)胞存活率沒有顯著影響。

表1 表面活性劑對(duì)細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of surfactants on survival rate of cells

2.4.2 細(xì)胞膜通透性

在普魯蘭的生物合成過程中，麥芽三糖單體首先在胞內(nèi)合成，然后跨過細(xì)胞膜分泌到胞外并聚合成普魯蘭[1,24]，所以，細(xì)胞膜通透性的大小將影響到普魯蘭合成速率的高低。采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞通透性進(jìn)行測(cè)定，以PI攝取率定量表示細(xì)胞通透性的大小，結(jié)果見圖4。與對(duì)照相比，吐溫80對(duì)PI攝取率的影響很小，而斯潘80則大幅度地提高了PI攝取率（4～5 倍）；復(fù)配條件下的PI攝取率與單獨(dú)添加斯潘80的結(jié)果相近。由此可見，斯潘80極大地提高了細(xì)胞膜的通透性，但斯潘80和吐溫80的作用沒有累加性。

圖4 表面活性劑對(duì)細(xì)胞PI攝取率的影響Fig. 4 Effect of surfactants on PI uptake of cells

2.4.3 普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性分析

研究表明，吐溫80在普魯蘭分批發(fā)酵過程中會(huì)提高FKS活性水平[12]。本研究考察斯潘80和吐溫80對(duì)普魯蘭生物合成途徑中3 種關(guān)鍵酶（PGM、UGP和FKS）活性的影響，結(jié)果見圖5。可以發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)第24小時(shí)，除吐溫80對(duì)FKS活性沒有顯著影響外，其他添加條件下的PGM、UGP和FKS活性均明顯高于對(duì)照。在第48小時(shí)，斯潘80單獨(dú)添加仍然能提高PGM、UGP和FKS的活性，吐溫80對(duì)3 種關(guān)鍵酶活性均無影響，復(fù)配物僅可以提高FKS活性。此外，由圖5還可以看出，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的前期（24 h），PGM和UGP具有更高的活性；而在轉(zhuǎn)化后期（48 h），F(xiàn)KS活性更高。以上酶活結(jié)果表明，在生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭的過程中，斯潘80對(duì)關(guān)鍵酶活性的提高均具有積極作用，而吐溫80僅在轉(zhuǎn)化前期提高了PGM和UGP的活性。

圖5 表面活性劑對(duì)普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性的影響Fig. 5 Effect of surfactants on activities of key enzymes involved in pullulan biosynthesis

2.4.4 胞內(nèi)UDPG水平

作為普魯蘭生物合成的最重要的前體物質(zhì)之一，胞內(nèi)UDPG水平是事關(guān)普魯蘭能否高效合成的關(guān)鍵因素[1,21]。在生物轉(zhuǎn)化的24 h和48 h，不同表面活性劑添加方式下的胞內(nèi)UDPG含量見圖6。可以發(fā)現(xiàn)，在底物充足的情況下，普魯蘭快速合成時(shí)（第24小時(shí)）的胞內(nèi)UDPG水平比第48小時(shí)的高。與對(duì)照相比，斯潘80和吐溫80分別將第24小時(shí)胞內(nèi)UDPG含量提高了40.7%和102.4%。至第48小時(shí)，由于底物葡萄糖基本耗盡（數(shù)據(jù)未給出），胞內(nèi)UDPG含量均下降至較低的水平（約1.2 mg/g）。

圖6 表面活性劑對(duì)胞內(nèi)UDPG水平的影響Fig. 6 Effect of surfactants on intracellular UDPG level

2.4.5 胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)水平及比率

普魯蘭的生物合成離不開能量物質(zhì)的充足供給[16]。測(cè)定不同表面活性劑添加條件下的胞內(nèi)能量物質(zhì)ATP和ADP含量，計(jì)算ATP/ADP比率，結(jié)果見圖7。在第24小時(shí)，斯潘80和吐溫80均可以提高胞內(nèi)ATP含量和ATP/ADP比率，體現(xiàn)出比對(duì)照具有更強(qiáng)的ATP再生能力，最終胞內(nèi)有充足的ATP供給用于普魯蘭的快速合成。特別地，吐溫80在提高胞內(nèi)ATP含量和再生方面發(fā)揮著更為重要的作用。至第48小時(shí)，斯潘80和吐溫80雖然仍能將胞內(nèi)ATP維持在較高的水平，但ATP的再生能力均低于對(duì)照。

圖7 表面活性劑對(duì)胞內(nèi)ATP水平和ATP/ADP比率的影響Fig. 7 Effect of surfactants on intracellular ATP level and ATP/ADP ratio

3 討 論

表面活性劑素有“工業(yè)味精”的美稱，是一類用途廣泛的精細(xì)化工產(chǎn)品，在食品、藥品以及化妝品制造等領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用[25]。在微生物發(fā)酵領(lǐng)域，表面活性劑可以通過增大細(xì)胞膜的通透性、改變酶活性調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成[26-29]。作為非離子型表面活性劑，斯潘和吐溫常以乳化劑的形式應(yīng)用于食品加工中[30]。已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，吐溫80在普魯蘭發(fā)酵生產(chǎn)中對(duì)于提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量起到了積極作用[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，20 g/L斯潘80和5 g/L吐溫80在全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭過程中提高了細(xì)胞合成普魯蘭的能力，同時(shí)，普魯蘭的合成效率均高于前人研究的結(jié)果[11-13]。為探究斯潘80和吐溫80提高普魯蘭合成效率的生理機(jī)制，分別從細(xì)胞特性、關(guān)鍵酶活性、物質(zhì)與能量代謝等多個(gè)角度進(jìn)行了探索。

在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，將細(xì)胞始終保持在較高活性是實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化的基本保障，而部分表面活性劑（如Triton X-100）卻對(duì)細(xì)胞活性表現(xiàn)出一定的抑制作用[31]。本研究細(xì)胞存活率的結(jié)果表明，斯潘80和吐溫80對(duì)細(xì)胞活性幾乎沒有影響，可以確保不同轉(zhuǎn)化條件下的出芽短梗霉細(xì)胞均能維持正常的生理代謝。在此基礎(chǔ)上，斯潘80和吐溫80的添加提高了細(xì)胞膜的通透性，不僅有利于底物進(jìn)入胞內(nèi)與酶作用，還加速了胞內(nèi)合成的普魯蘭跨膜向胞外分泌，進(jìn)而提高了普魯蘭的合成效率。

根據(jù)出芽短梗霉合成普魯蘭的代謝途徑，底物葡萄糖首先在PGM和UGP的催化下合成前體物質(zhì)UDPG，然后UDPG在FKS的作用下合成麥芽三糖單體物質(zhì)，最終麥芽三糖在FKS的作用下跨膜聚合形成普魯蘭[1,18,32]。因此，提高PGM和UGP的活性有利于增加胞內(nèi)UDPG的供給，而提高FKS的活性將加速UDPG的消耗，最終促進(jìn)普魯蘭的合成。本研究普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性和胞內(nèi)UDPG水平的結(jié)果表明，斯潘80和吐溫80在普魯蘭合成期（24 h）均提高了PGM和UGP的活性，提升了胞內(nèi)UDPG水平。特別地，斯潘80提高了FKS活性，加速了UDPG向普魯蘭的轉(zhuǎn)化。由于吐溫80更有利于胞內(nèi)UDPG的供給，而斯潘80更有利于UDPG的消耗，因此在相同轉(zhuǎn)化時(shí)間下，添加斯潘80獲得的普魯蘭產(chǎn)量比添加吐溫80的結(jié)果要高，體現(xiàn)出更高的普魯蘭合成效率。

與此同時(shí)，能量物質(zhì)ATP的供給與消耗速率也是影響普魯蘭生物合成效率的重要因素。胞內(nèi)ATP含量體現(xiàn)ATP合成和利用的綜合結(jié)果，而ATP/ADP比率則反映ATP的再生能力[33]。本研究結(jié)果表明，吐溫80在提高胞內(nèi)ATP含量和促進(jìn)ATP再生方面比斯潘80有更好的效果，能將胞內(nèi)ATP維持在較高的水平，從而為普魯蘭的快速合成提供充足的能量供給。

斯潘80和吐溫80有類似的分子結(jié)構(gòu)，使得它們可以復(fù)配使用而增加效果[34]。本研究在單獨(dú)添加的基礎(chǔ)上，也考察了斯潘80和吐溫80復(fù)配在生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭中的作用，復(fù)配條件下的普魯蘭產(chǎn)量和合成效率只比單獨(dú)添加略高，沒有體現(xiàn)出累加效應(yīng)。該結(jié)果可能與斯潘80和吐溫80復(fù)配比例不當(dāng)有關(guān)，有待今后進(jìn)一步研究。

綜上，本研究考察了多種表面活性劑在全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭中的作用，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化液中添加20 g/L斯潘80或/和5 g/L吐溫80均有利于普魯蘭合成效率的提高。在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)了細(xì)胞存活率、細(xì)胞膜通透性、普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性、胞內(nèi)UDPG含量以及能量代謝物質(zhì)水平和比率，部分解析了斯潘80和吐溫80提高普魯蘭合成效率的生理機(jī)制。研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)普魯蘭高產(chǎn)提供了一種可行的方法，同時(shí)也為其他類似結(jié)構(gòu)微生物多糖的高效合成提供新的思路。