四川省稻城縣3個(gè)藏香豬豬場腹瀉樣本4種病毒的檢測

張 敏，楊丹嬌，劉怡雯，吳建平，藍(lán) 嵐，葉忠明，何宗偉

（1.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 甘孜藏族自治州 626000；2.稻城縣農(nóng)牧科技和供銷合作局，四川 甘孜藏族自治州 627750）

在養(yǎng)豬業(yè)中腹瀉是一種常見、多發(fā)對養(yǎng)豬業(yè)危害較為嚴(yán)重的影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要原因之一，能引起不同年齡、品種的豬發(fā)病，并能使患病豬死亡的病毒性疫病之一。近些年來腹瀉所造成的豬死亡的數(shù)量逐漸上升，根據(jù)資料顯示，從2010 年起由病毒造成的腹瀉在我國多個(gè)省份都有暴發(fā)，僅在南方10省就導(dǎo)致100 萬頭以上仔豬死亡[1]。其中仔豬腹瀉最為嚴(yán)重，導(dǎo)致仔豬腹瀉的原因復(fù)雜，細(xì)菌感染、飼養(yǎng)管理、霉變飼料和環(huán)境因素等都能引起仔豬腹瀉，但最為嚴(yán)重的是由病毒感染所引起的腹瀉，所帶來的損失也是最大，是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要因素之一。其中豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea virus, PEDV）、豬δ 冠狀病毒（Porcine Delta Corona virus, PDCoV）、傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）和豬A 群輪狀病毒（Porcine Group A Rotavirus, GARV）是造成豬腹瀉最主要的4 種病毒。PEDV、PDCoV、TGEV 屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，GARV 是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，而且4 種病毒的臨床癥狀以及病理變化過程都十分相似，都以嘔吐、水樣腹瀉和脫水等癥狀為主。會(huì)使飼料報(bào)酬下降，無形中使豬場的飼養(yǎng)成本增加了許多，并且還能讓豬的抵抗力下降，使其他疾病更容易發(fā)生，而且在康復(fù)以后也可能會(huì)成為僵豬，是在世界各養(yǎng)豬場廣泛流行的疾病之一，該病有一定的季節(jié)性，多發(fā)生于冬末春初的寒冷季節(jié)。

藏香豬作為稻城縣重要的養(yǎng)殖品種之一，是當(dāng)?shù)厝嗣裰匾慕?jīng)濟(jì)來源，但是由于飼養(yǎng)管理、基礎(chǔ)設(shè)施等多種因素導(dǎo)致各種疫病和傳染病發(fā)生率極高，其中仔豬腹瀉尤為嚴(yán)重，是造成豬場經(jīng)濟(jì)損失的重要因素之一，但并沒有對該地區(qū)仔豬腹瀉情況的報(bào)道和調(diào)查，流行病學(xué)資料和豬的感染情況基本屬于空白，但當(dāng)?shù)刎i場時(shí)有因?yàn)樽胸i腹瀉導(dǎo)致的死亡，給豬場帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，所以試驗(yàn)采用RT-PCR 方法對稻城縣3 個(gè)發(fā)生腹瀉的豬場采集的共50 份腹瀉樣本，進(jìn)行4 種腹瀉病毒的檢測，旨在查清3 個(gè)豬場腹瀉的病因，為豬場的有效治療和防控腹瀉病毒提供參考，減少因腹瀉帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

試驗(yàn)從稻城縣3 個(gè)發(fā)生腹瀉的豬場共采集了50 份樣本，其中在2018 年1 月木拉鄉(xiāng)豬場采得25份仔豬腹瀉樣本，該豬場仔豬存欄750 頭，發(fā)病60頭，無死亡；2018 年2 月在傍河鄉(xiāng)豬場采得10 份樣本，該豬場仔豬存欄200 頭，發(fā)病18 頭，無死亡；2018 年2 月在金珠鎮(zhèn)豬場采得15 份腹瀉樣本，該豬場仔豬存欄70 頭，發(fā)病26 頭，無死亡。

1.2 主要儀器和試劑

高速離心機(jī)（5801，Eppendorf 公司），凝膠成像儀（Universal HoodⅡ, BIO- RAD 公司），電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），異丙醇溶液、75%冰乙醇、DPEC 水、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker TRIZOL 試劑、氯仿溶液。

1.3 RNA 的提取和cDNA 的合成

根據(jù)Trizol 說明書提取糞便樣品的總RNA。按照Super Script TM III Reverse Transcriptase（TAKARA,CHN）使用說明書將提取的病毒總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA；-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR 檢測4 種病毒

PEDV、TGEV、GARV 的檢測方法參考曹恭貌等四川部分豬場PEDV、TGEV、GARV 和PKV 感染狀況調(diào)查中報(bào)道的方法[2]，PDCoV 的檢測方法參考彭艷伶等在涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV 和GARV 感染檢測中報(bào)道的方法[3]，所有引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物具體信息見表1。

表1 檢測4 種病毒的引物信息

反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：用4 種病毒的cDNA 模板與其對應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。體系為10 體系，上下引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL、cDNA 模板1 μL、酶5 μL。

擴(kuò)增條件：PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃55 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃8 min，4 °C 保存。

反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物5 μL 在含核酸染料的凝膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，并點(diǎn)等體積的DNA MarkerⅡ作對照，在電泳儀中電泳20～40 min，電泳完成后再凝膠成像儀中觀察是否有條帶以及條帶出現(xiàn)情況，進(jìn)行結(jié)果判定。將檢測結(jié)果為陽性的核酸樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序比對分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，從3 個(gè)豬場50 份腹瀉樣本中PEDV 檢出陽性樣本30 份，樣本總陽性率為60%，場陽性率為100%，各個(gè)豬場PEDV 陽性情況見表2。PDCoV、TGEV、GARV 3 種病毒未檢出。部分PEDV的電泳圖見圖1。

表2 3 個(gè)豬場PEDV 的檢出率

圖1 PEDV RT-PCR 擴(kuò)增部分結(jié)果

因此可知，3 個(gè)豬場都感染了PEDV 且感染率極高，是3 個(gè)豬場腹瀉的主要病原。

3 討論

稻城縣仔豬腹瀉嚴(yán)重，但發(fā)病原因不清楚。本試驗(yàn)對3 個(gè)豬場的腹瀉樣本進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果表明，PEDV 的檢出率十分高，確定PEDV 是腹瀉的主要病因，因此加強(qiáng)對病毒性腹瀉的防控是提高豬場經(jīng)濟(jì)收入的有效措施。近年來藏香豬的養(yǎng)殖發(fā)展十分迅速，PEDV 帶來的損失也較為嚴(yán)重，該研究進(jìn)一步為仔豬腹瀉的防控提供參考。雖然其余3 種病毒未檢出，但豬腹瀉的新病原PDCoV 也逐漸受到關(guān)注。已有研究證實(shí)，從臨床樣本中分離的PDCoV 可引起5 日齡新生仔豬劇烈腹瀉，產(chǎn)生與PEDV、PoRV（輪狀病毒）等常見腹瀉病原極為相似的臨床癥狀及病理組織學(xué)變化，在防治PEDV 時(shí)也應(yīng)該重視其余3 種病毒[4]，雖然沒有檢出但不排除健康豬帶毒的情況，以防止3 種病毒的突發(fā)帶來的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

關(guān)于藏香豬PEDV 的流行病學(xué)資料較少，但試驗(yàn)結(jié)果與2013—2014 年四川省9 個(gè)地區(qū)的代表樣品，PEDV 的陽性率為86.67%相近[6]，同時(shí)也符合四川省以PEDV 陽性率最高的調(diào)查結(jié)果[2]。2016 年1—6 月，對我國26 個(gè)省份收集到的896 份血清樣品進(jìn)行PEDV、PoRV 和TGEV 抗體檢測，結(jié)果顯示PEDV 和TGEV 抗體陽性率分別為62.3%、23.0%[7]。薛瑞雪等調(diào)查顯示，山東省部分地區(qū)豬場PEDV 和TGEV 感染率分別為34.96%、2.21%[6]。大量資料表明，PEDV 是造成我國豬場仔豬腹瀉的主要原因[8]，因此對藏香豬腹瀉調(diào)查以及加強(qiáng)對仔豬腹瀉防控十分必要。

稻城仔豬腹瀉情況嚴(yán)重，仔豬腹瀉病因復(fù)雜，病毒感染是最常見的因素[9]，因此試驗(yàn)同時(shí)對4 種病毒進(jìn)行了檢測，最終只檢測出PEDV，表明PEDV 是造成仔豬腹瀉的主要原因，這為提高豬場經(jīng)濟(jì)收入、仔豬腹瀉的防控提供參考[10]。