四川省稻城縣3個藏香豬豬場腹瀉樣本4種病毒的檢測

張 敏，楊丹嬌，劉怡雯，吳建平，藍 嵐，葉忠明，何宗偉

（1.甘孜藏族自治州畜牧業科學研究所，四川 甘孜藏族自治州 626000；2.稻城縣農牧科技和供銷合作局，四川 甘孜藏族自治州 627750）

在養豬業中腹瀉是一種常見、多發對養豬業危害較為嚴重的影響養豬業發展的重要原因之一，能引起不同年齡、品種的豬發病，并能使患病豬死亡的病毒性疫病之一。近些年來腹瀉所造成的豬死亡的數量逐漸上升，根據資料顯示，從2010 年起由病毒造成的腹瀉在我國多個省份都有暴發，僅在南方10省就導致100 萬頭以上仔豬死亡[1]。其中仔豬腹瀉最為嚴重，導致仔豬腹瀉的原因復雜，細菌感染、飼養管理、霉變飼料和環境因素等都能引起仔豬腹瀉，但最為嚴重的是由病毒感染所引起的腹瀉，所帶來的損失也是最大，是影響養豬業發展的重要因素之一。其中豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea virus, PEDV）、豬δ 冠狀病毒（Porcine Delta Corona virus, PDCoV）、傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）和豬A 群輪狀病毒（Porcine Group A Rotavirus, GARV）是造成豬腹瀉最主要的4 種病毒。PEDV、PDCoV、TGEV 屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，GARV 是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，而且4 種病毒的臨床癥狀以及病理變化過程都十分相似，都以嘔吐、水樣腹瀉和脫水等癥狀為主。會使飼料報酬下降，無形中使豬場的飼養成本增加了許多，并且還能讓豬的抵抗力下降，使其他疾病更容易發生，而且在康復以后也可能會成為僵豬，是在世界各養豬場廣泛流行的疾病之一，該病有一定的季節性，多發生于冬末春初的寒冷季節。

藏香豬作為稻城縣重要的養殖品種之一，是當地人民重要的經濟來源，但是由于飼養管理、基礎設施等多種因素導致各種疫病和傳染病發生率極高，其中仔豬腹瀉尤為嚴重，是造成豬場經濟損失的重要因素之一，但并沒有對該地區仔豬腹瀉情況的報道和調查，流行病學資料和豬的感染情況基本屬于空白，但當地豬場時有因為仔豬腹瀉導致的死亡，給豬場帶來了較大的經濟損失，制約了當地經濟和養殖業的發展，所以試驗采用RT-PCR 方法對稻城縣3 個發生腹瀉的豬場采集的共50 份腹瀉樣本，進行4 種腹瀉病毒的檢測，旨在查清3 個豬場腹瀉的病因，為豬場的有效治療和防控腹瀉病毒提供參考，減少因腹瀉帶來的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

試驗從稻城縣3 個發生腹瀉的豬場共采集了50 份樣本，其中在2018 年1 月木拉鄉豬場采得25份仔豬腹瀉樣本，該豬場仔豬存欄750 頭，發病60頭，無死亡；2018 年2 月在傍河鄉豬場采得10 份樣本，該豬場仔豬存欄200 頭，發病18 頭，無死亡；2018 年2 月在金珠鎮豬場采得15 份腹瀉樣本，該豬場仔豬存欄70 頭，發病26 頭，無死亡。

1.2 主要儀器和試劑

高速離心機（5801，Eppendorf 公司），凝膠成像儀（Universal HoodⅡ, BIO- RAD 公司），電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），異丙醇溶液、75%冰乙醇、DPEC 水、RNA反轉錄試劑盒、DNA Marker TRIZOL 試劑、氯仿溶液。

1.3 RNA 的提取和cDNA 的合成

根據Trizol 說明書提取糞便樣品的總RNA。按照Super Script TM III Reverse Transcriptase（TAKARA,CHN）使用說明書將提取的病毒總RNA 反轉錄成cDNA；-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR 檢測4 種病毒

PEDV、TGEV、GARV 的檢測方法參考曹恭貌等四川部分豬場PEDV、TGEV、GARV 和PKV 感染狀況調查中報道的方法[2]，PDCoV 的檢測方法參考彭艷伶等在涼山地區豬腹瀉樣本中PEDV、PDCoV 和GARV 感染檢測中報道的方法[3]，所有引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物具體信息見表1。

表1 檢測4 種病毒的引物信息

反應體系和反應條件：用4 種病毒的cDNA 模板與其對應的引物進行擴增。體系為10 體系，上下引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL、cDNA 模板1 μL、酶5 μL。

擴增條件：PCR 擴增條件為：95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃55 s，35 個循環，72 ℃8 min，4 °C 保存。

反應結束后，取產物5 μL 在含核酸染料的凝膠板上進行點樣，并點等體積的DNA MarkerⅡ作對照，在電泳儀中電泳20～40 min，電泳完成后再凝膠成像儀中觀察是否有條帶以及條帶出現情況，進行結果判定。將檢測結果為陽性的核酸樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序比對分析。

2 試驗結果

試驗結果表明，從3 個豬場50 份腹瀉樣本中PEDV 檢出陽性樣本30 份，樣本總陽性率為60%，場陽性率為100%，各個豬場PEDV 陽性情況見表2。PDCoV、TGEV、GARV 3 種病毒未檢出。部分PEDV的電泳圖見圖1。

表2 3 個豬場PEDV 的檢出率

圖1 PEDV RT-PCR 擴增部分結果

因此可知，3 個豬場都感染了PEDV 且感染率極高，是3 個豬場腹瀉的主要病原。

3 討論

稻城縣仔豬腹瀉嚴重，但發病原因不清楚。本試驗對3 個豬場的腹瀉樣本進行了檢測，檢測結果表明，PEDV 的檢出率十分高，確定PEDV 是腹瀉的主要病因，因此加強對病毒性腹瀉的防控是提高豬場經濟收入的有效措施。近年來藏香豬的養殖發展十分迅速，PEDV 帶來的損失也較為嚴重，該研究進一步為仔豬腹瀉的防控提供參考。雖然其余3 種病毒未檢出，但豬腹瀉的新病原PDCoV 也逐漸受到關注。已有研究證實，從臨床樣本中分離的PDCoV 可引起5 日齡新生仔豬劇烈腹瀉，產生與PEDV、PoRV（輪狀病毒）等常見腹瀉病原極為相似的臨床癥狀及病理組織學變化，在防治PEDV 時也應該重視其余3 種病毒[4]，雖然沒有檢出但不排除健康豬帶毒的情況，以防止3 種病毒的突發帶來的經濟損失[5]。

關于藏香豬PEDV 的流行病學資料較少，但試驗結果與2013—2014 年四川省9 個地區的代表樣品，PEDV 的陽性率為86.67%相近[6]，同時也符合四川省以PEDV 陽性率最高的調查結果[2]。2016 年1—6 月，對我國26 個省份收集到的896 份血清樣品進行PEDV、PoRV 和TGEV 抗體檢測，結果顯示PEDV 和TGEV 抗體陽性率分別為62.3%、23.0%[7]。薛瑞雪等調查顯示，山東省部分地區豬場PEDV 和TGEV 感染率分別為34.96%、2.21%[6]。大量資料表明，PEDV 是造成我國豬場仔豬腹瀉的主要原因[8]，因此對藏香豬腹瀉調查以及加強對仔豬腹瀉防控十分必要。

稻城仔豬腹瀉情況嚴重，仔豬腹瀉病因復雜，病毒感染是最常見的因素[9]，因此試驗同時對4 種病毒進行了檢測，最終只檢測出PEDV，表明PEDV 是造成仔豬腹瀉的主要原因，這為提高豬場經濟收入、仔豬腹瀉的防控提供參考[10]。