從江香豬SIM1 基因SNP 位點遺傳效應分析

李 俊，毛世明，陳大芳，龍清孟，周 迪，李 平，張 勇，張 雄，馮文武，李明勇，尹楊莎，唐明宗

（1.貴州省種畜禽種質測定中心，貴州 貴陽 550021；2 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；

3.貴州省畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550021）

SIM1（Single-minded 1）基因是一種編碼與神經發生有關的轉錄因子，是堿性-螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）轉錄因子超家族中新發現的亞家族成員之一[1]，通過影響下丘腦視上核和室旁核神經內分泌細胞在哺乳動物能量平衡調節中的作用，從而影響動物的采食行為，可導致食欲過盛、肥胖和體重增加[2]。Holder 等[3]研究發現SIM1基因平衡易位會導致兒童肥胖。Tolson 等[4]發現SIM1+/-和SIM1-/-小鼠食量增加，比同窩正常小鼠肥胖，且催產素（Oxytocin）和黑素皮質素激素（MC4R）在下丘腦內的表達量顯著降低；由此，Traurig 等[5]推測SIM1基因可能參與瘦素—黑素皮質激素—催產素這一調控途徑，進而導致肥胖，并通過DNA 測序發現SIM1基因一處非編碼區突變位點與印第安人的體脂指數顯著相關。Zhao 等[6]應用輻射雜交細胞系（RH）將SIM1基因定位到豬染色體1p13，并且在SIM1基因內含子七的607 bp（A/G）和SIM1外顯子八的780 bp（C/T）處檢測到兩個多態位點，發現該突變和生長率、背膘厚、眼肌面積、腿部脂肪重、日增重以及肌內脂肪含量顯著相關。因此推測，SIM1基因可能是影響豬胴體性狀、生長性狀和肉質性狀的潛在功能基因。本文采用PCR 產物直接測序法，對已篩選到的SIM1基因3 個SNP 位點進行驗證和基因分型，分析該基因對從江香豬胴體性狀的遺傳效應，為進一步利用分子標記選育提純從江香豬奠定理論基礎。

1 試驗與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2018 年3 月至2019 年6 月在貴州省貴陽市烏當區羊昌鎮綠生源香豬生態福利養殖場和中心實驗室進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗動物 試驗樣品為74 頭從江香豬耳組織，采自貴陽市烏當區綠生源香豬生態福利養殖場。用耳號鉗取耳組織1.5 g，標記后分別放入裝有1 mL 70%乙醇的2 mL 離心管中，帶回實驗室-20 ℃保存，用于DNA 提取。

1.2.2 主要試劑及儀器 組織基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、瓊脂糖、DL 2 000 DNA Marker 等試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；去離子水、無水乙醇、TAE 緩沖液等試劑實驗室自備。PCR 擴增儀（C1000 Touch），凝膠成相系統（G：BOX F3），紫外分光光度計（NanoDrop-ONE），去離子純水儀（Milli-Q Intergral 3）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA 提取 用基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統照相保存，并用紫外分光光度計測量每個DNA 樣品濃度3 次，取其平均值，用ddH2O 將所有DNA 樣品調至100ng/μL，-20℃保存備用。

1.3.2 引物設計與PCR 擴增 參照GenBank（登錄號為NC_010443.5）提供的豬SIM1基因序列，以及李俊等[7]利用DNA 池在從江香豬群體中篩查到SIM1基因的12 個SNP 位點，運用NCBI 中的Primer-BLAST 設計引物，委托賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成，引物序列及擴增條件見表1。

表1 SIM1 基因引物序列、退火溫度、擴增長度及區域

1.3.3 PCR 反應體系及條件 采用25 μL PCR 反應體系，即DNA 模板2.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 個循環；72 ℃再延伸10 min；最后得到的PCR 產物4 ℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，凝膠成像系統照相保存，將檢測合格樣品送英濰捷基（上海）貿易有限公司測序。

1.3.4 統計分析 測序得到的DNA 序列用DNAStar等軟件進行序列對比，篩選SNP 位點，計算不同位點在受試群體中的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數（Ne）、群體遺傳純合度（Ho）、雜合度（He）和多態信息含量（PIC）；根據最小二乘線性模型，分析不同基因型與樣本胴體性狀的關聯效應。

2 結果與分析

2.1 PCR 產物檢測

PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均顯示為一條特異性條帶，其片段長度P1、P2、P3 分別為193 bp、194 bp、173 bp，與目的片段相符，條帶清晰、整齊無拖尾，可用于測序（圖1）。

2.2 測序結果分析

運用SeqMan 軟件對所有樣品的測序結果分析發現（圖2），C77T 位點分型為MM、MN、NN 基因型；C225T 位點分型為CC、CT、TT 基因型，A426G 位點分型為AA、AG、GG 基因型。通過序列對比發現，MM 基因型、CC 基因型、AA 基因型個體的序列與GenBank上提交的序列相一致，定義為野生型，NN 基因型、TT 基因型、GG 基因型定義為突變型，MN 基因型、CT 基因型、AG 基因型為雜合型。

圖1 部分PCR 產物電泳檢測結果

圖2 SIM1 基因3 個SNP 位點測序結果

2.3 SNP 位點的基因型頻率及遺傳特異性分析

從群體遺傳學角度分析從江香豬SIM1基因SNP 位點的基因型和等位基因頻率（表2）。從表2可看出，對于C77T 位點，MM 基因型頻率最高，表現為優勢基因型；M、N 等位基因頻率分別為87.8%、12.2%，且M 為優勢等位基因。對于C225T 位點，CC基因型頻率最高，表現為優勢基因型；C、T 等位基因頻率分別為76.3%、23.7%，且C 為優勢等位基因。在A426G 位點上，AA 基因型和AG 基因型頻率一樣，均為35.1%，A、G 等位基因頻率分別為52.6%、47.4%，且A 為優勢等位基因。

通過對C77T、C225T、A426G 位點的遺傳結構進行分析，均發現這3 個SNP 位點在試驗群體中純合度（Ho）較高，雜合度（He）則相對較低，表明這3 個SNP 位點在群體中的變異較小；3 個位點的有效等位基因數（Ne）分別為1.27、1.56、1.99；而A426G 位點最接近于實際檢測到的2 個等位基因數，說明該位點的等位基因在群體中分布最均勻；3 個位點的多態信息含量（PIC）分別為0.19、0.30、0.37，表明C77T 位點表現為低度多態（PIC＜0.25），C225T、A426G 位點變現為中度多態（0.25＜PIC＜0.50），經χ2適合性檢驗結果表明，C77T、A426G、C225T 位點均未偏離Hardy-weinberg 平衡（P＞0.05）。

表2 從江香豬SIM1 基因3 個SNP 位點基因型頻率、等位基因頻率及遺傳特異性分析

2.4 連鎖不平衡分析與單倍型構建

利用SHEsis 在線軟件對SIM1基因3 個多態位點進行連鎖不平衡參數估計及單倍型構建，見表3和表4，結果表明，r2和D'大于0，說明3 個多態位點間分別處于連鎖不平衡狀態。可構建7 種單倍型，即：M-C-G、M-C-A、M-T-A、N-C-A、M-T-G、N-T-A、N-C-G；分別命名為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7，其頻率分別為39.3%、28.2%、13.0%、8.1%、7.2%、3.4%、0.7%。

表3 3 個SNP 位點之間的連鎖不平衡參數估計

表4 3 個SNP 位點的單倍型構建及頻率

2.5 SIM1 基因不同基因型與胴體性狀的關聯性分析

從江香豬SIM1基因C77T 位點、C225T 位點、A426G 位點不同基因型與肌內脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚的最小二乘分析結果見表5。由表5 可知，在C77T 位點上，MM 基因型的肌內脂肪和眼肌面積高于MN 和NN 基因型，但差異不顯著（P＞0.05），背膘厚為NN 基因型＜MN 基因型＜MM 基因型，且NN 基因型與MM 基因型差異顯著（P＜0.05），皮厚為NN 基因型最低。對于C225T 位點，肌內脂肪和眼肌面積均為CC 基因型高于CT 基因型和TT 基因型，背膘厚和皮厚均為TT 基因型低于CC 基因型和CT基因型，且差異均不顯著（P＞0.05）。對A426G 位點，肌內脂肪和眼肌面積為GG 基因型＞AG 基因型＞AA基因型，但差異不顯著（P＞0.05），背膘厚和皮厚均為AA 基因型最低，且AA 基因型的背膘厚顯著低于GG 基因型（P＜0.05）。

表5 不同基因型與胴體性狀的關聯性分析

通過SIM1基因的3 個SNP 位點不同基因型的聚合，產生15 種聚合基因型，采用最小二乘法分析與聚合基因型與胴體性狀的關聯性（表6），結果顯示，肌內脂肪含量最高的為MMCCAA 組合基因型，最低的為MMTTAA 組合基因型；眼肌面積最高的為MNCCGG 組合基因型，最低的為MNTTAA 組合基因型；背膘厚和皮厚最低的均為MNTTAA 組合基因型，背膘厚和皮厚最高的均為MNCCGG 組合基因型；但不同聚合基因型間的肌內脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚差異均不顯著（P＞0.05）。

表6 3 個SNP 位點聚合基因型與胴體性狀的關聯性分析

3 討論

SIM1基因是人類和鼠肥胖癥的候選基因，缺失SIM1基因可導致視前核神經元細胞不發育，影響哺乳動物能量平衡和采食行為。Holder 等[8]報道，一名患者1 號和6 號染色體之間發生易位，破壞6 號染色體上的SIM1基因，導致出現肥胖癥。而小鼠試驗研究[4]顯示，SIM1基因純合子小鼠在出生后不久就死亡，而雜合子小鼠能夠存活下來且出現食欲過盛和肥胖的癥狀，可見SIM1基因在維持動物能量、食欲和體脂方面起著重要的作用。但目前關于SIM1基因的研究主要在人和小鼠上，在家畜家禽方面的研究較少。郭曉令等[9]對169 頭國內外豬種的SIM1基因SNP 分析發現，國外豬種均存在CC、CT、TT 基因型，且純合基因型個體的背膘厚顯著大于雜合基因型個體；但在國內豬種中只發現TT 基因型，這與陳哲等[10]在金皮F2 代資源家系豬SIM1基因發現CC、CT 和TT 3 種基因型不一致，推測其原因可能是品種差異或者SNP 位點的不同造成，且TT 基因型個體的背膘厚高于CC 基因型個體的背膘厚。Nezer等[11]、Beeckmann 等[12]和De 等[13]均在豬SIM1基因所在區域發現一個影響背膘厚、采食量和生長率的數量性狀基因座（Quantitative Trait Locus, QTL）。由此可見，SIM1基因對豬的脂肪沉積具有顯著效應。

本研究通過對74 頭從江香豬SIM1基因擴增的PCR 產物全部測序發現，與李俊等[7]利用DNA 池篩選出的SIM1基因C77T、C225T、A426G 位點結果相一致，證實DNA 混池篩查出的SNP 位點也具有一定的可靠性。而多態性分析發現3 個SNP 位點分別產生3 種不同的基因型，其中MM 基因型、CC 基因型、AA 基因型表現為優勢基因型，且M、C 和A 表現為優勢等位基因。遺傳結構分析顯示3 個SNP 位點在該群體中分布均勻，且能比較合理地提供遺傳信息。因此，通過連鎖不平衡分析發現，上述3 個SNP 位點兩兩之間均處于連鎖不平衡狀態。一個群體中單倍型的頻率不能小于0.03%，因此單倍型頻率未達到0.03%的未參與統計，對應的單倍型組合也應忽略，SHEsis 在線軟件在單倍型分析過程中，系統會自動刪除不符合條件的單倍型組合[14-15]，從而構建7 種單倍型，其中H1、H2 和H3 為主要單倍型。由于該研究的試驗樣本較少，發現的SNP 位點少，有些單倍型所占比例太小，對試驗結果造成一定的誤差，未進行單倍型與胴體性狀的關聯性分析，因此，還需進一步擴大試驗樣本加以驗證。

關聯性分析發現，C77T、C225T、A426G 位點不同基因型以及聚合基因型與肌內脂肪、眼肌面積、皮厚之間差異均不顯著（P＞0.05），C77T、A426G 位點不同基因型從江香豬背膘厚差異顯著（P＜0.05）。MM基因型、CC 基因型、GG 基因型的肌內脂肪和眼肌面積高于其他基因型；NN 基因型、TT 基因型、AA 基因型的背膘厚和皮厚低于其他基因型；肌內脂肪最高的為MMCCAA 聚合基因型，眼肌面積最高的為MNCCGG 聚合基因型；背膘厚和皮厚最低的均為MNTTAA 聚合基因型。但由于本試驗樣本數少、品種單一，具有一定局限性。因此，在今后的研究中，將擴大樣本數，并在肌內脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚差異較大品種中驗證這3 個SNP 位點是否對從江香豬胴體性能產生影響，為今后推動從江香豬高產肉性能品系的選育提供參考。

4 結論

本試驗發現SIM1基因C77T、C225T、A426G 位點可能是影響從江香豬胴體性能的3 個分子標記，可以將MM 基因型、CC 基因型、GG 基因型、MMCCAA聚合基因、MNCCGG 聚合基因型作為影響從江香豬肌內脂肪和眼肌面積的有利基因型；將NN 基因型、TT 基因型、AA 基因型和MNTTAA 聚合基因型作為影響從江香豬背膘厚和皮厚有利基因型。