快速直接PCR 檢測(cè)豬肺炎支原體方法的建立及其應(yīng)用

徐引弟，張青嫻，王治方，焦文強(qiáng)，李海利，朱文豪，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal Pneumonia of Swine,MPS），又稱(chēng)豬地方流行性肺炎（Swine Enzootic Pneumonia），俗稱(chēng)豬喘氣病，是由豬肺炎支原體引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病。主要臨診癥狀為咳嗽、氣喘、呼吸困難、日增重減少、食欲不振，長(zhǎng)期生長(zhǎng)不良，飼料報(bào)酬大幅下降。肺組織的病理變化特征主要是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈肉樣或蝦肉樣實(shí)變。本病廣泛分布于世界各地，主要為慢性、高接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率的主要特點(diǎn)。該病常與其他呼吸道病原體如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌或胸膜肺炎放線桿菌等病原協(xié)同引起繼發(fā)性感染肺炎，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬圓環(huán)病毒2 型協(xié)同感染引起豬呼吸道病綜合征[1-2]。

豬肺炎支原體不但能引起豬地方流行性肺炎，還是豬呼吸道病綜合征的一種原發(fā)性病原。支原體只要持續(xù)存在，就可導(dǎo)致呼吸道疾病的發(fā)生，并且也可導(dǎo)致其它疫苗免疫失敗。豬支原體病流行于世界各地，不僅在我國(guó)存在，在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的美國(guó)、澳大利亞等國(guó)也普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前控制該病的主要措施為疫苗免疫和豬場(chǎng)支原體的凈化等手段。

本研究旨在建立豬肺炎支原體快速直接PCR檢測(cè)方法，用于河南省豬場(chǎng)發(fā)生呼吸道疾病的豬肺炎支原體的鑒定，從而為豬肺炎支原體的流行病學(xué)、綜合防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料與參考毒株

病料：2017 年1 月至2018 年12 月在河南省大中型豬場(chǎng)發(fā)生重癥肺炎呼吸困難、肺發(fā)生實(shí)變豬的肺臟348 份。陽(yáng)性對(duì)照為豬肺炎支原體168 疫苗株，購(gòu)自南京天邦生物公司。

1.2 主要試劑和酶

瓊脂糖、DL 2 000 Marker、T5 Direct PCR Kit（動(dòng)物組織）購(gòu)自擎科生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 PCR 方法的建立

1.3.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中豬肺炎支原體16s RNA 基因設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，用于豬肺炎支原體的擴(kuò)增，由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：上游引物P1：5'-ACGCGTCGACAGAGTTTG ATCCTG-3'，下游引物P2：5'-CGCGGATCCGCTA CCTTGTTACGA-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段1 600 bp。

1.3.2 模板制備 取適量典型的支原體肺炎的肺組織，碾磨，取1 μL 上清液作為模板。

1.3.3 PCR 檢測(cè) PCR 體系為50 μL：2×T5 Direct PCR Mix 25 μL，10 μmol/L P1、P2 各1 μL，模板1 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃3 min，然后35 個(gè)循環(huán)：98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃10 s；最后72 ℃5 min；取10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4 PCR 產(chǎn)物的序列分析 將陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序，序列用Blast 軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.5 特異性試驗(yàn) 將本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)，按1.3.3 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳觀察結(jié)果。

1.3.6 敏感性試驗(yàn) 測(cè)定DNA 濃度，用無(wú)菌去離子水按10 倍濃度梯度分別稀釋調(diào)整至100～0.001 μg/μL，分別進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 PCR 鑒定方法的應(yīng)用

2017 年1 月至2018 年12 月從河南省及周邊省份豬場(chǎng)發(fā)生呼吸困難豬的實(shí)變肺臟共采集348份，用建立的PCR 方法進(jìn)行鑒定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 豬肺炎支原體PCR 方法的建立

2.1.1 PCR 鑒定 將疑似豬肺炎支原體的肺組織提取DNA，進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1 擴(kuò)增出預(yù)期大小符合的片段。陽(yáng)性片段回收，連接T 載體，測(cè)序，比對(duì)，序列與168 株同源性均在95%以上。

圖1 豬肺炎支原體組織PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.1.2 特異性試驗(yàn) 用PCR 方法對(duì)豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均未擴(kuò)增出片段（圖2），證明本PCR 方法有較好的特異性。

圖2 PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 敏感性試驗(yàn) 敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其PCR檢測(cè)的靈敏度可達(dá)0.1 μg/μL DNA（圖3）。對(duì)0.01 μg/μL 和0.001 μg/μL 均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明該體系擴(kuò)增下限濃度為0.1 μg/μL。

圖3 PCR 敏感性試驗(yàn)

2.2 PCR 方法的應(yīng)用結(jié)果

2017 年1 月至2018 年12 月從河南省豬場(chǎng)發(fā)生呼吸困難豬的實(shí)變肺臟共采集348 份，用建立的PCR 方法鑒定出豬肺炎支原體226 份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為64.94%。

3 討論

豬肺炎支原體可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡、品種、性別的豬都易感染，該病一年四季都可發(fā)生。病豬和隱性帶毒豬是主要傳染源，無(wú)臨診癥狀有病理變化豬，或無(wú)臨診癥狀無(wú)病理變化陰性帶菌豬較常見(jiàn)。豬肺炎支原體的診斷方法主要有病原的分離和鑒定，ELISA 方法檢測(cè)抗體、PCR、原位雜交、芯片檢測(cè)等。PCR 方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學(xué)診斷中較為普遍的一種方法。病原的分離鑒定是檢測(cè)病原最為準(zhǔn)確、有效的方法，但也是最復(fù)雜、最難、最費(fèi)時(shí)間的方法[3-12]。

而常規(guī)的PCR 檢測(cè)操作中，對(duì)病變肺組織進(jìn)行研磨后，豬肺炎支原體的含量極少，因此PCR 方法容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，普通PCR 檢測(cè)方法使用的Taq 酶對(duì)極微量的DNA 檢出極其困難，極易造成假陰性結(jié)果，而本試驗(yàn)中使用的T5 PolStar DNA Polymerase 專(zhuān)為動(dòng)物組織的直接PCR 擴(kuò)增而設(shè)計(jì)，樣品可以直接作為模板而無(wú)需提取DNA，為針對(duì)動(dòng)物來(lái)源模板優(yōu)化的高保真DNA 聚合酶，具有快速擴(kuò)增及耐受抑制物的能力，是在具有校正活性的高保真DNA 聚合酶基礎(chǔ)上改造而來(lái)，融合特殊的DNABinding 結(jié)構(gòu)，使其具有超快的延伸速度，保真度比普通的Taq DNA 聚合酶高20 倍，PCR Mix 中含特異性增強(qiáng)因子SuperPrime 及延伸增強(qiáng)因子Extension Enhancer，可在模板質(zhì)量不佳或低濃度情況下仍可擴(kuò)增成功，配合優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液極大地減少擴(kuò)增條件的探索，大幅縮短了操作時(shí)間，整個(gè)過(guò)程30 min 內(nèi)完成。

本研究建立了豬肺炎支原體的快速直接PCR方法，該方法快速敏感準(zhǔn)確，陽(yáng)性率達(dá)64%以上，表明豬肺炎支原體在患呼吸道疾病的豬群中感染率較高，是危害豬場(chǎng)的較為普遍、嚴(yán)重的病原。對(duì)河南省豬肺炎支原體的病原流行病學(xué)研究、疫苗研究、綜合防制提供參考。