逆流浸泡玉米漿中微生物的變化及其作用研究

金渭武 焦琳 沈雪梅 陳博 李義 陶進 佟毅

摘 ?????要： 逆流浸泡工藝已被廣泛應用于玉米濕法淀粉生產中。玉米逆流浸泡中微生物會不斷生長、繁殖，代謝并產生活性物質作用于玉米籽粒，提高浸泡效果。但目前對玉米浸泡過程中微生物的變化規律及其作用研究不多。采集了中糧生化龍江工廠中兩批6個不同時間段的玉米浸泡液（2、10、18、26、33和41 h）共12個樣品，測定其有機酸組成、pH和細菌群落結構變化，浸泡液中的有機酸含量和pH都隨著浸泡時間逐漸降低，乳酸含量從30 g/L左右（2 h）降低到<10 g/L（41 h），pH維持在4.0±0.2。整個浸泡過程中，乳酸桿菌屬占絕對優勢并在浸泡前期發酵產生大量乳酸，從2到41 h占比分別為95.8%，89.6%，76.1%，77.9%，52.2%和 58.4%。芽孢桿菌屬豐度從浸泡10 h開始上升并成為第二優勢菌。

關 ?鍵 ?詞：逆流浸泡;乳酸;乳酸菌;微生物群落結構

中圖分類號：TQ 033 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）06-1228-04

Abstract： The countercurrent steeping of corn has been widely used in the production of starch. During the corn soaking， lactic acid bacteria fermentation broth was added to increase the soaking effect of corn and reduce the use of sulphur. In this paper， 12 samples of 6 batches of corn soaking liquid （2， 10， 18， 26， 33 and 41 h） were collected from COFCO biochemical Longjiang factory. The organic acid composition， pH and bacterial composition were determined. Both the concentration of organic acid and the pH gradually decreased with time. The lactic acid concentration decreased from about 30 g/L （2 h） to <10 g/L （41 h）， and the pH maintained at 4.0 ± 0.2. During the whole soaking process， Lactobacillus was dominant， accounting for 95.8%， 89.6%， 76.1%， 77.9%， 52.2% and 58.4%， respectively， from 2 h to 41 h. The abundance of Bacillus increased from 10 h as the second dominant bacteria.

Key words： Countercurrent steeping; Lactic acid; Lactic acid bacteria; Microbial community

玉米淀粉生產工藝主要分為干法工藝和濕法工藝兩種，干法工藝較濕法工藝所得產品中蛋白質、脂肪含量高，淀粉純度低，因此目前淀粉生產主要采用濕法工藝。而濕法玉米淀粉生產工藝因為浸泡方式不同又分為靜止浸泡法和逆流浸泡法。相對于靜止浸泡法，逆流浸泡法使玉米與浸泡液中可溶性物質始終保持較大的濃度差以利于玉米中可溶性物質向浸泡液中轉移，從而能更好地降低浸泡玉米中的可溶性物質含量，便于在洗滌時徹底除去殘余的可溶性物質，提高淀粉純度。因此，逆流浸泡法被濕法玉米淀粉生產工廠廣泛采用[1]。

許多研究表明，在玉米浸泡液中添加乳酸可顯著縮短玉米淀粉生產的浸泡時間，降低亞硫酸的使用濃度[2，3]。而玉米浸泡過程不僅僅是物理擴散過程，也是生物化學變化的過程。在浸泡工藝條件下，溫度、酸度等都非常適合微生物尤其是乳酸菌的生長。因此，浸泡過程也是乳酸菌發酵產生乳酸的過程，這也是玉米浸泡中沒有外加乳酸而浸泡液中會含有較高乳酸的原因。另外研究也表明外接一定比例的乳酸菌發酵液可以大大縮短玉米浸泡的時間，提高玉米浸泡液的質量[4，5]。基于乳酸菌發酵產生乳酸提高玉米浸泡效果，降低二氧化硫的使用量。在濕法玉米淀粉生產中，趙壽經等采用從玉米浸泡液中分離的一株嗜熱乳酸菌C15，通過發酵罐培養后再接種到玉米浸泡液中，使噸玉米淀粉產出的硫磺用量大幅降低[4]。同時玉米浸泡也是微生物生長、繁殖，新陳代謝產生各種活性物質并作用于玉米籽粒的過程。但迄今為止，玉米浸泡過程中微生物的群落變化并沒有被系統地研究過。本文通過對中糧生化工廠玉米濕法淀粉生產中，不同時間段的玉米逆流浸泡液進行采樣，測定其有機酸組成、pH 值及其微生物組成，系統分析玉米浸泡中微生物群落結構變化，探討其在玉米浸泡中的作用。

1 ?實驗部分

1.1 ?實驗材料

玉米浸泡液分別取自中糧生化龍江公司玉米浸泡車間2#罐和7#罐，兩罐時間間隔為2 d。準備50 mL滅菌離心管12個，待玉米入罐后，在同一浸泡罐中分別于 2、10、18、26、33和41 h 取玉米漿1管（50 mL/管），取樣后迅速冷凍保存，以備提取細菌基因組和各種指標測定。

1.2 ?儀器設備

儀器：安捷倫1260，色譜柱：Bio-RadAminex

HPX-87HColumn（300 mm×7.8 mm 8 μm），BioTeke自動核酸提取儀（百泰克，北京），NanoDrop 2000C（美國Thermo），Eppendorf 離心機。

1.3 ?實驗方法

1.3.1 ?玉米浸泡液有機酸測定

玉米浸泡液中有機酸的測定參照賈錚等[6]液相方法略作修改，以5 mM 硫酸溶液為流動相，流速0.50 mL/min，柱溫55 ℃，DAD檢測波長為210 nm，以保留時間結合待測物質的紫外特征吸收光譜進行定性分析，結合外標法進行定量。液相樣品制作如下：待玉米浸泡液完全解凍搖勻，取100 μL漿液加入2.4 mL雙蒸水稀釋25倍，13 000 r/min離心3 min取上清，過水系液相膜放入液相瓶中，標記好樣品名稱，上機檢測。

1.3.2 ?細菌基因組提取

取10 mL 玉米浸泡液12 000 r/min離心5 min，棄上清，使用細菌基因組DNA快速提取試劑盒（北京BioTeke）在AU1001-96核酸提取儀（北京BioTeke）上進行樣品的DNA提取。提取的DNA利用1%的瓊脂糖凝膠上進行檢測，使用2000C NanoDrop（美國Thermo）檢測濃度。利用干冰將濃度合格的樣品（濃度≥50 ng/μL，體積>30 μL）寄送上海派森諾生物科技有限公司進行16S rDNA 的V3-V4區域擴增、測序及數據分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?玉米浸泡液中的有機酸及pH變化

兩批樣品的液相結果都顯示逆流浸泡液中的有機酸含量隨浸泡時間的增加而逐漸降低，乳酸濃度從2 h 的將近30 g/L逐漸變為41 h的不到10 g/L。前18 h玉米漿中乳酸含量維持在較高水平（>15 g/L），浸泡到26 h，玉米漿中的乳酸含量也還大于10 g/L（見表1）。浸泡液中乳酸含量大幅降低主要發生在2～10 h，而33～41 h乳酸含量降低不明顯。另外隨著浸泡時間的增加，浸泡液的pH進一步下降，但在整個浸泡過程中維持窄幅變動（4.0 ±0.2）。

玉米逆流浸泡過程中玉米始終留在罐內，用泵將浸泡液在罐內一邊自身循環一邊向前一級罐內輸送，始終保持新的亞硫酸溶液與浸泡時間最長（即將結束浸泡）的玉米接觸，而新入罐的玉米與即將排出的浸泡液接觸，從而保持最佳的浸泡效果。因此，隨著時間的增加，浸泡液中的SO2會不斷升高，盡管有機酸含量降低，但浸泡液的pH值還會逐漸降低。另外，在逆流浸泡中，隨著浸泡時間的延長，浸泡液中的糖類、氨基酸等有機浸出物越來越少，浸泡液作為細菌發酵培養基營養越來越貧瘠，不利于微生物的生長繁殖，發酵產生的乳酸少。同時由于浸泡液中SO2濃度的提高，也會抑制乳酸菌的生長。基于兩者疊加作用，在浸泡后期，乳酸的含量保持在相對較低的水平。

2.2 ?浸泡過程中的細菌群落結構變化

2.2.1 ?門水平上的細菌群落結構變化

在整個浸泡過程中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為優勢細菌，且厚壁菌門占絕對優勢（始終>73.3%）。隨著浸泡時間的延長，硬壁菌門豐度逐漸降低，變形菌門豐度逐漸增加，從2 h時的3.8%增加到41 h時的24% 。同時，放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度也隨浸泡時間的增加而上升。當浸泡時間為33 h時，放線菌門豐度達到最高，約為2.0%（見圖1）。

2.2.2 ?屬水平上的細菌群落結構變化

從屬的水平看，整個浸泡過程中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）為優勢菌，其中乳酸桿菌屬占絕對優勢（從2 h到41 h分別占比為95.8%， 89.6%， 76.1%，77.9%， 52.2% 和 58.4%）。浸泡10 h后，芽孢桿菌屬細菌豐度開始增加（占1.5%），18 h后基本穩定在9.5%左右，33 h后豐度維持在12.0%左右。當浸泡33h時，物種多樣性明顯較高，鏈球菌屬、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和腸球菌屬（Enterococcus）的豐度均達到較高豐度，而后降低（見圖2）。

2.2.3 ?細菌群落結構變化與有機酸含量相關性

隨著浸泡時間的延長，浸泡液逐漸從老酸液更換為新酸液，乳酸含量也不斷下降（表1），而乳酸桿菌占比與乳酸含量呈強正相關（R2=0.86）。這表明在浸泡過程中乳酸桿菌發育較好，并發酵產生大量乳酸，這也是連續浸泡過程中，未添加外源乳酸，當浸泡液在逐漸變老時（逆向，從41到2 h）乳酸含量大量增加的原因。同時，反觀41到2 h，浸泡液中的SO2濃度的逐漸降低，這有利于乳酸桿菌發酵，而乳酸桿菌發酵產生乳酸并不斷積累，抑制了其它細菌的生長。細菌群落結構變化與有機酸含量相關性顯示（圖3），乳酸桿菌屬細菌豐度與系統中大多數其他細菌豐度呈負相關，特別是芽孢桿菌屬屬細菌豐度，且兩者對其他菌的豐度影響正好相反。

此外，乳酸含量從41～33 h變化不明顯，表明這個階段乳酸桿菌的生長受到抑制，從33～10 h，乳酸含量逐漸變大，表明乳酸桿菌處于生長旺盛并大量產生乳酸、乙酸等有機酸，而10～2 h，乳酸含量大幅度上升，表明此階段是乳酸桿菌大量產生乳酸時期（見圖4）。

2.2.4 ?浸泡時間與細菌群落結構變化的關系

根據各樣品中細菌物種組成和豐度，在屬水平（豐度前50的屬）作聚類分析熱圖（圖5），該12個樣品6個時間大致可分為三組：即浸泡2和10 h時的L7.2，L2.2，L2.10和L7.10為第一組，18 h和26 h的 L2.18，L7.18，L.26和 L7.26為第二組， 33h和41 h的L2.33，L7.41，L2.41和L7.33為第三組。這與PCA作圖的結果相似（圖6），表明物種多樣性隨浸泡時間發生變化，并在一段時間內相對保持穩定。

3 ?結 論

玉米浸泡過程是微生物生長、繁殖，代謝并產生活性物質作用于玉米籽粒的生物化學變化過程。采用逆流浸泡工藝，前期浸泡液中的SO2濃度比較低，利于乳酸菌發酵產生大量乳酸。同時乳酸作用于玉米胚乳細胞壁，使其形成一系列的洞或坑，便于浸泡水的進入并促進可溶物溶出。因此，浸泡前期（2～18 h），浸泡液的營養也比較豐富，乳酸桿菌生長旺盛，豐度高，發酵產生乳酸多。

隨著浸泡時間延長，SO2濃度升高，乳酸桿菌生長受到抑制，芽孢桿菌屬豐度增加，表明芽孢桿菌屬更耐SO2。因此，在玉米浸泡24 h時，外加一定比例產乳酸的芽孢桿菌C15，該菌屬芽孢桿菌屬，可發酵產乳酸，從而促使玉米浸泡后期繼續發酵產生乳酸。因此推測，這可能是33～41 h期間，浸泡液中乳酸含量維持一定濃度的原因。乳酸的形成，加速玉米中蛋白質的膨脹和軟化，同時又維持了浸泡液中的Ca2+、Mg2+等金屬離子的濃度，促進SO2與玉米蛋白的結合，從而減少了硫磺的使用。此外，研究表明，許多芽孢桿菌還會分泌一些蛋白酶[7]，這有利于降解玉米中的蛋白質，從而便于淀粉釋出。

通過本文系統研究逆流浸泡過程玉米漿中微生物群落結構及其體系中有機酸和pH變化，全面了解工藝微生物與微生物間、微生物與化合物間相互作用，為玉米浸泡機理研究奠定基礎，同時為工藝改進與優化提供理論指導。

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