亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用對肺癌細胞抗氧化和細胞周期蛋白的影響

萬鷹昕，張 平，李 楠

(北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023)

【關鍵字】亞硒酸鈉；白藜蘆醇；抗氧化；周期蛋白

據研究表明，肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和威脅最大的惡性腫瘤之一[1]，其中，80%以上為非小細胞肺癌[2]。硒是一種對機體具有生物活性調節能力的基本元素，也是生物所必需的微量元素。硒通過自身或中間產物來保護細胞免受自由基的損傷[3-4]。亞硒酸鈉具有腫瘤預防、化療增敏和促進細胞凋亡的作用[5-6]。亞硒酸鈉還具有抗氧化、消除體內的氧自由基與過氧化物、抗炎反應、抗高血壓、抗重金屬等藥理作用[7-8]。亞硒酸鈉是目前應用最普遍的硒強化劑，但其安全濃度范圍非常窄，高劑量對生物體有毒害作用。

白藜蘆醇是一種普遍存在于自然界的多酚類化合物，近年研究表明，白藜蘆醇對機體無毒副作用，其藥理作用主要是抗氧化、抗自由基等方面，從而預防癌癥和心血管疾病[9-11]。但白藜蘆醇價格高，且單獨作用于肺癌細胞相對于亞硒酸鈉效果不明顯[12]。為減輕硒作用于癌細胞時的毒副作用，張平等人研究了亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯合應用于肺癌細胞，結果表明與亞硒酸鈉單獨作用于肺癌A549細胞相比，25 μmol/L白藜蘆醇和亞硒酸鈉的聯合使細胞的存活率更低，且當亞硒酸鈉濃度≥5 μmol/L時，與對照組相比，肺癌細胞的存活率明顯降低[12]。但相關機制還不清楚。為此，本論文研究亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用對肺癌細胞抗氧化性和細胞周期蛋白的影響，以便進一步理解亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用對肺癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549細胞購于中國協和醫科大學基礎醫學研究所。亞硒酸鈉、白藜蘆醇、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)，購于美國Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶(含EDTA與不含EDTA)、DMEM/F12培養基，購于美國Hyclone公司；細胞凋亡分析試劑盒，購于美國Genview公司；微量谷胱甘肽(glutathione，GSH)測試盒、細胞丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測試盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)測試盒，購于南京建成科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

多功能酶標儀、恒溫培養箱，為美國 Thermo公司產品；超凈工作臺，北京百劍空氣凈化設備廠；TE2000-M倒置顯微鏡，購于日本Nikon公司；BS110S型電子天平，美國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養細胞復蘇后進行傳代培養。在進行傳代過程中，PBS緩慢沖洗1～3次，勿吹起細胞，用胰蛋白酶酶解細胞，在倒置顯微鏡下觀察，底壁上約80%細胞呈現圓粒狀，細胞間連接將要分離時，迅速吸掉胰酶溶液，避免胰蛋白酶處理過度。然后向100 mm×20 mm培養皿內加入新鮮培養液4 mL，小心吹起皿底的細胞，盡量避免產生氣泡，再分裝。

1.3.2 實驗分組實驗組分為對照組、亞硒酸鈉組、白藜蘆醇組、亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯用組。根據張平等人的研究[12]，本實驗將亞硒酸鈉和白藜蘆醇的濃度定為2.0和25.0 μmol/L。對照組含A549細胞和無血清培養基。

1.3.3 四甲基偶氮唑鹽法檢測細胞活性A549細胞在培養皿中培養，取對數期的細胞，在96孔板中鋪板，在37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中繼續培養24 h，然后加配制好的受試物，處理24 h，吸棄廢液，添加MTT溶液處理4 h，再用DMSO處理10 min，最后用酶標儀檢在532 nm波長處測定D(532)值,按下式計算A549細胞的存活率。

A549 細胞存活率=[D(532)實驗組-D(532)空白組]/[D(532)對照組-D(532)空白組]

空白組為不含A549細胞的實驗組。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡和活性氧將對數生長期的細胞配制成濃度為3×105個/mL的細胞懸液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混勻的細胞懸液，37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養24 h。然后加入受試物，培養箱中培養24 h。用檢測細胞凋亡的試劑盒進行處理，最后用流式細胞術檢測細胞凋亡情況；同樣，用檢測ROS的試劑盒進行處理，然后用流式細胞術檢測細胞的ROS情況。

1.3.5 酶標儀檢測谷胱甘肽、丙二醛的表達水平將對數生長期的細胞配制成濃度為3×105個/mL的細胞懸液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混勻的細胞懸液，37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養24 h。然后加入受試物，接著培養24 h。分別用檢測GSH、MDA試劑盒進行處理，最后用酶標儀檢測GSH、MDA的表達水平。

1.3.6 Western blot檢測P-Rb蛋白實驗分組同1.3.2，用藥物處理A549細胞后，收集細胞，提取總蛋白，然后用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白樣品濃度。上樣同樣質量總蛋白后電泳、轉膜、封閉，一抗4℃孵育過夜，用TBST洗后，加入二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗后，用化學發光試劑盒檢測P-Rb蛋白表達；用顯影儀掃描并拍照，對顯示的目的蛋白和相應β-actin的條帶進行灰度分析，以目的蛋白和內參β-actin條帶灰度的比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.4 統計分析

所有計量資料以平均值±標準差(xˉ±s)的形式表示，用SPSS軟件統計分析數據，采用單因素方差分析判斷各處理組之間的差異顯著性，LSD Duncan法檢驗進行兩兩比較，并用Origin作圖軟件分析。

2 結果

2.1 亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用對肺癌A549細胞存活率和凋亡率的影響

采用四甲基偶氮唑鹽法檢測細胞活性，流式細胞術檢測細胞凋亡，結果見表1。與對照組相比，2 μmol/L亞硒酸鈉單獨處理可使A549細胞存活率降低、凋亡率升高(P＜0.01)；25 μmol/L白藜蘆醇單獨處理后細胞存活率和凋亡率與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。當亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯用后，細胞的存活率降低至46.867%，且凋亡率上升至3.790%，相較于兩個單獨處理組，其存活率和凋亡率與對照組的差異性更為顯著(P均＜0.01)，這說明聯用組能降低細胞的存活率，促進A549細胞凋亡。

表1 亞硒酸鈉與白藜蘆醇鈉對A549細胞存活和凋亡的影響

圖1 亞硒酸鈉聯合白藜蘆醇對A549細胞GSH和MDA表達水平的影響

2.2 亞硒酸鈉聯合白藜蘆醇對A549細胞GSH和MDA表達水平的影響

用酶標儀檢測A549細胞中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的表達水平，結果見圖1。亞硒酸鈉與白藜蘆醇單獨處理組GSH表達水平與對照組相比差異無統計學意義。亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用組較對照組和單獨處理組的GSH表達水平顯著降低(P＜0.05)。

亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨處理組MDA表達水平與對照組相比差異無統計學意義，但亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用組MDA表達水平與對照組比較顯著升高(P＜0.05)。結果表明，亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用后對細胞造成了一定的氧化損傷。

2.3 亞硒酸鈉聯合白藜蘆醇對A549細胞ROS水平的影響

亞硒酸鈉和白藜蘆醇對A549細胞ROS水平的影響見圖2和表2。與對照組相比，亞硒酸鈉單獨處理可顯著增加A549細胞內ROS水平(P＜0.05)，白藜蘆醇單獨處理可顯著降低A549內ROS水平(P＜0.05)，而亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯用后，細胞內ROS表達水平與對照組和白藜蘆醇單獨處理組相比顯著升高(P＜0.05)，與亞硒酸鈉單獨處理組相比差異無統計學意義。表明亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯用能導致ROS水平升高。

表2 不同組別A549細胞ROS和周期蛋白相對表達量

2.4 亞硒酸鈉聯合白藜蘆醇對細胞周期蛋白P-Rb的影響

Rb是一種抑癌基因表達的蛋白，可以通過調控細胞周期G1期的檢驗點來調節細胞增殖。Western blot檢測P-Rb蛋白的表達，結果見圖3和表2。與對照組相比，亞硒酸鈉組A549細胞的P-Rb蛋白表達水平降低(P＜0.05)，白藜蘆醇組A549細胞的P-Rb的表達水平與對照組間的差異無統計學意義；但亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯用組p-Rb的水平較對照組、亞硒酸鈉組和白藜蘆醇組單獨處理組均顯著降低(P＜0.05)。

圖2 流式細胞術檢測不同組別A549細胞ROS水平

圖3 Western blot檢測結果條帶

3 討論

亞硒酸鈉是一種對機體細胞有一定毒性作用的無機硒化合物，白藜蘆醇是從植物體內提取出來的天然活性成分且在一定范圍內對機體細胞無毒副作用。亞硒酸鈉(2 μmol/L)和白藜蘆醇(25 μmol/L)單獨處理A549細胞時，細胞存活率分別為77.43%和111.67%，但兩者聯合處理后，細胞存活率為46.87%。生物體供能的主要來源和合成ATP激素及許多生理活性所不可缺少的物質都是氧。但機體在利用氧的同時，氧自身也發生了一系列反應，生成包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥自由基等氧自由基或活性氧簇的ROS。而ROS生成后一般會被一些特定的酶類清除。當細胞內自由基生成過量或抗氧化防御系統受損時，ROS的產生和清除的動態平衡遭到破壞，導致ROS水平升高。ROS的大量堆積會引起細胞氧化應激或脂質過氧化等，最終使細胞凋亡或死亡[13]。機體參與抗氧化作用的酶主要包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽轉移酶等。若這一機制受到損傷，則多余氧自由基就會直接作用于機體，導致機體損傷。當各種致癌因素使氧自由基產生過量、機體抗氧化和修復機制受損時，機體就會產生氧化應激的損傷，并導致各種腫瘤的產生。捕捉和清除自由基、保護DNA蛋白質等生物大分子免受活性氧損害，才能抑制腫瘤生長[14]。GSH是細胞內重要的自由基清除劑，可以與細胞內的自由基或超氧離子反應，拮抗細胞的氧化損傷。通過細胞內GSH表達水平的測定，可以反映出細胞內的氧化還原水平。MDA是細胞脂質過氧化的主要產物之一。可以通過細胞內MDA的表達水平了解細胞膜脂質過氧化程度，從而間接了解細胞膜系統受損程度。本研究結果顯示，亞硒酸鈉單獨處理后，A549細胞內GSH表達水平有所降低，MDA表達水平和ROS表達水平有所升高。白藜蘆醇單獨處理后，細胞內ROS表達水平降低，而GSH和MDA表達水平的活力均無顯著性變化。亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯用后與亞硒酸鈉單獨處理相比，ROS表達水平有所上升，GSH表達水平降低和MDA表達水平升高。ROS在細胞中具有雙重的功能，其既能通過DNA損傷和線粒體途徑誘導細胞凋亡，也能通過激活其它信號通路來調節細胞的生存或死亡狀態。

細胞周期調控在細胞增殖和凋亡中起重要的作用。張平等[12]在研究亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯合應用對肺癌細胞的協同作用的實驗中發現，亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯用能夠阻滯肺癌A549細胞于細胞周期的G0/G1期。聯用組肺癌A549細胞P-Rb蛋白的相對蛋白質表達水平差異顯著(P＜0.05)，這可能可以解釋聯用使肺癌A549細胞的細胞周期處于G0/G1期，無法繼續進行細胞分裂，最終導致肺癌A549細胞凋亡。

本研究分析和評價了亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨處理和聯用對肺癌細胞拮抗的效果，通過比較單獨處理和聯用對A549細胞的細胞存活和凋亡、GSH、MDA、ROS的檢測得出如下結論：與對照組相比，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯合降低了肺癌A549細胞的存活率，促進其凋亡；同時，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯合應用降低GSH的表達水平，增加MDA和ROS的表達水平。降低周期蛋白P-Rb的表達水平，阻滯細胞于細胞S期。通過研究亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯用對肺癌細胞的抗氧化性研究可以得出，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯用對肺癌細胞有抑制增殖、促進凋亡的作用。其機制可能與增加氧化損傷及降低P-Rb蛋白表達有關。