肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體對BSA致大鼠肝纖維化的保護作用研究

張石蕾，由淑萍，趙 軍，劉 濤，*

(1.新疆醫科大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學護理學院基礎護理學教研室，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆維吾爾族自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

近年來，化學及藥理學研究顯示，肉蓯蓉苯乙醇總苷(Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)是肉蓯蓉發揮藥效的主要物質基礎之一[1]。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和免疫調節等多種生物活性，本課題組的前期研究發現，CPhGs對牛血清白蛋白誘導的肝纖維化大鼠有一定的預防和治療作用[2]。有文獻報道，CPhGs存在吸收差、口服利用度低等缺點，使其應用受到影響[3]。脂質體藥物遞送系統具有生物相容性良好，改善藥物的穩定性、溶解性，增強藥物療效，降低給藥頻率的作用，近年來在基礎及臨床醫學領域逐漸受到關注[4]。因此本文以脂質體為藥物載體包裹中藥成分CPhGs制成CPhGs脂質體，然后應用于肝纖維化模型動物考察CPhGs脂質體對肝纖維化大鼠血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、 層 粘連蛋 白 (Laminin， LN)，透明質酸酶(Hyaluronidase，HA)，III型前膠原(Procollagen III，PC III)和 IV 型膠原(Collagen-IV，IV-C)含量的影響，肝臟組織膠原纖維分布情況的變化，膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和膠原蛋白III(Collagen III)mRNA表達含量的差異，以及α-平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin，α-sma)和Collagen Ⅰ蛋白表達水平的差異，闡明其對肝臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛血清白蛋白購于美國Sigma-Aldrich公司；谷丙轉氨酶(ALT/GPT)測試盒、谷草轉氨酶(AST/GOT)測試盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠Hyaluronidase-1(HYAL1)ELISA Kit，大鼠laminin(LN)ELISA Kit購于武漢華美生物工程有限公司；大鼠PCⅢ(ProcollagenⅢ)ELISA Kit，Rat COL4(Collagen TypeⅣ)ELISA Kit購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Precision Plus ProteinTMDual Color Standards購于美國BIO-RAD公司；兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗α-SMA多克隆抗體、兔抗CollagenⅠ多克隆抗體購于北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 儀器

CK-40型熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；全波長自動酶聯免疫反應檢驗測試儀購于美國Thermo Scientific公司；FluorChem E化學發光高靈敏凝膠成像儀購于美國Protein Simple公司；Zeta sizer Nano series ZS90粒徑分析儀購于英國Malvern公司。

1.3 CPhGs脂質體的制備

采用薄膜分散法制備CPhGs脂質體。稱取卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇(質量比為1∶2∶2)，溶于適量氯仿和甲醇混合溶劑中(體積比為2∶1)，在49～50℃下旋轉使其成為膜狀，加入250 μg/mL的CPhGs不斷旋轉水化，使磷脂膜轉入水中形成脂質體，所得脂質體用0.45 μm的微孔濾膜擠壓4～5次，0.22 μm的微孔濾膜擠壓18～20次，真空冷凍干燥24 h，即得粒徑均勻的苯乙醇總苷脂質體。使用激光粒度分析儀檢測其粒徑分布，在透射電鏡下觀察粒子外形，HPLC法測定其載藥量及包封率。

1.4 實驗動物、模型制備和給藥

SPF級雄性健康SD大鼠，體質量180～220 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(新)2018-0002。SPF環境實驗動物使用許可證號SYXK(新)2018-0003，飼養受控環境條件為室溫25℃、光/暗周期12 h，大鼠自由進食與飲水，喂飼標準顆粒飼料，常規適應性飼養3 d后使用。

65只SD大鼠隨機分為2組，即正常對照組13只，BSA致敏模型組52只。模型組大鼠采用課題組前期[2]建立的方法制備大鼠免疫性肝纖維化模型，造模分為致敏階段和尾靜脈攻擊階段。致敏階段：大鼠均多點皮下注射sc含BSA 9 g/L弗氏不完全佐劑，每次0.5 mL，共5次。前2次注射間隔為14 d，后3次注射間隔為7 d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼內眥靜脈叢采血，采用雙向瓊脂擴散法檢測大鼠血清抗BSA抗體。攻擊階段：剔除模型組中4只未檢測到BSA抗體的大鼠，余48只大鼠隨機分為4組即模型組、空白脂質體組、肉蓯蓉苯乙醇總苷原料藥組、肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體組，每組12只，繼續尾靜脈注射BSA，每周2次，連續5周，注射劑量由每只2 mL逐漸遞增至每只4 mL。正常對照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水尾靜脈攻擊造模同時按設定劑量灌胃給藥每日1次，肉蓯蓉苯乙醇總苷原料藥組、肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體組給予相當于肉蓯蓉苯乙醇總苷原料藥物量125 mg/kg灌胃受試物(劑量參照文獻)[2]，正常對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，空白脂質體組按肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體組脂質體的量給藥。造模結束后繼續給予受試物4周，每日1次，總實驗周期共計15周。末次給藥后，禁食不禁水，24 h后按3～4 mL/kg用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，4℃放置2 h后以3 000 r/min離心10 min，留取血清待檢；處死所有大鼠，迅速剖取肝臟相同部位組織，以生理鹽水漂洗后，一部分用作組織病理學Masson染色，另一部分存于凍存管投于液氮并在-80℃條件下保存用作實時熒光定量PCR和Western blot檢測。

1.5 血清生化指標檢測

取大鼠血清樣品采用微板法檢測各組大鼠血清中ALT、AST濃度，ELISA法檢測中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C濃度的變化。

1.6 Masson染色

切取肝臟中間部分肝組織(約1 cm3)用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4～5 μm薄片，Masson染色，在光學顯微下觀察肝臟組織膠原纖維分布情況。

1.7 實時熒光定量PCR檢測大鼠肝組織CollagenⅠ和CollagenⅢ mRNA表達的影響

分別取每只大鼠肝組織30 mg，經勻漿后用Trizol提取各組肝組織中的總RNA，逆轉錄后進行實時熒光定量PCR CollagenⅠ和CollagenⅢ mRNA檢測，程序為：預變性95℃、30 s；變性95℃、3 s，退火60℃、30s，總共40個循環。引物由華大基因設計合成。CollagenⅠ：上游5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAA GAATG-3′，下游 5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCA C-3′。Collagen Ⅲ：上游 5′-GACACGCTGGTGCTCA AGGAC-3′，下游5′-GTTCGCCTGAAGGACCTCGTTG-3′。目的基因CT值經同一樣本的內參基因校正后計算各組間每個基因的ΔCT，通過 2-ΔΔCT計算組間對應基因的表達差異。

1.8 Western blot檢測大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達水平

分別取每只大鼠肝組織30 mg，經勻漿后用RIPA裂解液及離心處理，提取各組肝組織中的總蛋白，上樣于聚丙烯酰胺凝膠進行還原性SDS-PAGE電泳，濕轉(PVDF膜)，200 mA恒流電轉90 min。封閉液(5%脫脂奶粉)封閉PVDF膜過夜，用1×TBST緩沖液充分振蕩清洗，TBST稀釋抗體，一抗稀釋度為：α-sma，1∶ 5 000； Collagen Ⅰ ， 1∶ 5 000； β-actin， 1∶5 000。ECL顯色。FluorChem E化學發光高靈敏凝膠成像儀上檢測條帶灰度值。

蛋白相對表達水平=目的條帶灰度/β-actin條帶灰度×100%

1.9 統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計分析，各組數據結果以xˉ±s表示，計量資料采用方差分析，組間比較采用LSD法，等級資料采用秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的物理性質

采用前述方法制得的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的粒徑為(207.7±2.31)nm，Zeta電位為(-61.5±3.18)mV，圖1～3分別為肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體的透射電鏡圖像、粒度分布、Zeta電位分析圖譜，可見表面有厚度均勻的包衣包裹，且粒度分布均勻。肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體載藥量為(3.77±0.07)%，包封率為(37.2±0.30)%。

圖1 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體透射電鏡圖像

圖2 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體激光粒度儀粒度分布分析圖譜

圖3 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體Zeta電位分析圖譜

2.2 大鼠肝功能生化指標變化

大鼠血清肝功能生化指標ALT、AST濃度的變化見表1，與正常對照組相比較，模型組大鼠血清ALT、AST濃度顯著增加(P＜0.05)，且差異具有統計學意義；與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質體組、肉蓯蓉總苷原料藥組均能顯著降低模型大鼠血清ALT、AST濃度(P＜0.01)，空白脂質體組ALT、AST濃度下降不明顯(P＞0.05)；與肉蓯蓉總苷脂質體組比較，空白脂質體組、肉蓯蓉總苷原料藥組ALT、AST濃度顯著升高(P＜0.01)，差異具有統計學意義。

表1 Z各組大鼠血清肝功能生化指標ALT、AST濃度的變化(x±s)

2.3 大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C濃度比較

大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C濃度的比較見表2，與正常對照組相比較，模型組大鼠血清中LN、IV-C、HA、PC III濃度顯著增加(P＜0.05)。與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質體組、肉蓯蓉總苷原料藥組均能顯著降低模型大鼠血清中LN、HA、PC III濃度(P＜0.01)，空白脂質體組LN、HA、PC III濃度無明顯變化(P＞0.05)；與肉蓯蓉總苷脂質體組相比較，肉蓯蓉總苷原料藥組血清中PC III濃度變化不明顯(P＞0.05)，HA濃度顯著增加(P＜0.01)，LN水平有所上升(P＜0.05)；與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質體組能顯著降低大鼠血清中IV-C濃度(P＜0.01)，肉蓯蓉總苷原料藥組能降低大鼠血清中IV-C濃度(P＜0.05)；肉蓯蓉總苷原料藥組大鼠血清中IV-C濃度高于肉蓯蓉總苷脂質體組(P＜0.01)。

表2 各組大鼠血清LN、HA、PC III、IV-C濃度的變化

2.4 大鼠肝組織Masson染色結果

Masson膠原染色結果見圖4，顯示正常對照組的大鼠肝組織并無明顯的異常，未見炎細胞浸潤，肝小葉構造清晰而完整，肝細胞呈條索狀分布，未見有不規則血竇，匯管區無擴大，肝臟匯管區有極少量膠原纖維存在，肝小葉間未見纖維組織。與正常對照組相比較，模型組大鼠肝組織中纖維明顯增多，分布廣泛，可相互連接形成較粗大的纖維間隔，多位于匯管區和血管周圍。肉蓯蓉總苷脂質體組、肉蓯蓉總苷原料藥組大鼠肝組織中膠原纖維明顯減少，其中肉蓯蓉總苷脂質體組組肝組織結構恢復良好，趨向正常，效果優于肉蓯蓉總苷原料藥組。

圖4 各組大鼠肝組織Masson染色圖(100×)

2.5 大鼠肝組織CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表達情況

qPCR檢測結果見圖5，顯示模型組大鼠肝組織ECM調節因子(CollagenⅠ、CollagenⅢ)mRNA的表達水平較正常對照組大鼠肝組織明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。肉蓯蓉總苷脂質體組、肉蓯蓉總苷原料藥組與模型組相比，CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA的表達水平顯著降低(P＜0.01)，空白脂質體組較模型組無顯著性差異；與肉蓯蓉總苷脂質體組相比，肉蓯蓉總苷原料藥組肝組織CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表達水平顯著升高(P＜0.01)。

圖5 各組大鼠肝組織CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表達水平

2.6 各組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達情況

Western blot檢測結果見圖6，顯示與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白的表達水平明顯增加(P＜0.05)。與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質體組、肉蓯蓉總苷原料藥組顯著降低了肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白的表達，空白脂質體組α-sma和CollagenⅠ蛋白表達水平較模型組相比無顯著性差異；與肉蓯蓉總苷脂質體組相比，肉蓯蓉總苷原料藥組肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白的表達水平明顯增加(P＜0.05)。

圖6 各組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達情況

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種慢性刺激進行損傷修復時發生的病理變化，其特征為細胞外基(extracellular matrix，ECM)合成增多而降解相對減少，導致其在肝內過多沉積[5]。目前抗肝纖維化的主要策略包括：治療原發病，抑制ECM增生，促進ECM降解，抑制HSCs活化與誘導其凋亡[6]。

現代藥理研究表明，肉蓯蓉有潤腸通便、保肝、抗骨質疏松、抗氧化、抗衰老、抗疲勞等作用[7]。其中起主要作用的一類成分便是苯乙醇苷類物質。但是有研究發現，苯乙醇總苷滲透性差，腸道吸收不良、體內生物利用度低，口服劑量(100 mg/kg)后大鼠血清中松果菊苷水平極低，絕對生物利用度僅為0.83%[8-9]。脂質體靶向遞藥系統能在病變局部形成相對較高的藥物濃度，而脂質體就是其中一種重要的納米微粒，可提高藥物穩定性，增加藥物的溶解度[10]。Zhu[11]等人研究發現，與高良姜素原料藥相比，高良姜素脂質體能夠更好地在CCl4致小鼠肝毒性方面起到保護作用。

本實驗Masson染色結果顯示，模型組大鼠纖維組織明顯增生并向肝小葉內伸展，分布廣泛，可相互連接形成較粗大的纖維間隔，肉蓯蓉總苷脂質體組大鼠肝組織結構恢復良好，趨向正常，且效果優于肉蓯蓉總苷原料藥組。實驗中損傷模型大鼠的血清AST、ALT均明顯升高，肉蓯蓉總苷原料藥組、肉蓯蓉總苷脂質體藥物組對大鼠肝功能均有所改善，尤其以肉蓯蓉總苷脂質體藥物組的改善情況最為理想，較接近于正常組水平。肉蓯蓉總苷脂質體組能夠更有效的降低肝纖維化指標(LN、HA、PCⅢ、IV-C)，較其他組更接近于正常水平，但肉蓯蓉總苷原料藥組稍差。提示肉蓯蓉總苷脂質體組能夠改善肝纖維化大鼠的一般情況及肝功能，緩解肝臟纖維化程度，其作用強于相同劑量的肉蓯蓉總苷原料藥組，Masson染色結果也顯示，肉蓯蓉總苷脂質體組膠原沉積較原料藥組有所減輕，說明肉蓯蓉總苷脂質體組對抗肝細胞損傷作用比純藥有著明顯優勢，對肝臟保護，特別是對肝細胞保護有著確切的作用。

在肝纖維化初期，ECM主要成分由正常Ⅰ、Ⅳ型膠原為主轉變為Ⅰ、Ⅲ型膠原所占比例增大[12]。當HSC被激活后，α-SMA表達大量增加，并附著于假小葉增生的纖維膈內，與HSC的活化、增殖、復制呈正相關，是HSC活化的特有標志物[13]。本實驗研究結果顯示，與肉蓯蓉總苷脂質體組相比，肉蓯蓉總苷原料藥組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達水平顯著升高，提示可能是由于脂質體通過與靶細胞內吞、融合、釋放和吸附過程，增加肉蓯蓉總苷原料藥體內穩定性，從而達到提高保肝作用。

綜上可見，肉蓯蓉總苷脂質體組具有更強的抗肝纖維化作用。能夠使肝靶向性顯著增強，從而達到更好的保護肝臟細胞的作用。無論從肝功能數據還是病理結果分析均顯示肉蓯蓉總苷脂質體組均優于肉蓯蓉總苷原料藥組對肝纖維化大鼠肝臟的保護。