外源H2O2對鹽脅迫下小白菜種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響

任艷芳, 何俊瑜,*, 楊 軍, 韋愿娟

1 常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 常州 213164 2 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025

土壤鹽漬化已成為當(dāng)前全球極其重要的農(nóng)業(yè)與環(huán)境問題,有報道表明全球有20%的耕地和33%的灌溉農(nóng)田受到土壤鹽分的影響,且農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不合理的灌溉和過度施肥將進(jìn)一步加劇土壤次生鹽漬化[1]。已有研究表明,鹽漬條件下,植物體內(nèi)會發(fā)生滲透脅迫,同時,會造成離子平衡失調(diào)或離子毒害、植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除代謝紊亂,造成細(xì)胞氧化損傷,進(jìn)而對膜系統(tǒng)造成傷害,葉綠素降解、光合能力下降、營養(yǎng)虧缺等現(xiàn)象[2- 5],從而影響植物正常的生長發(fā)育,造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降,嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡,阻礙了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)[6- 7]。因此,探尋提高植物耐鹽途徑成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

利用外源物質(zhì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性是提高植物抵御不良環(huán)境的有效方法。過氧化氫(Hydrogen peroxide, H2O2)是生物體內(nèi)的一種活性氧分子,也是生物細(xì)胞應(yīng)答逆境脅迫的重要信號分子,廣泛參與植物的抗性反應(yīng)[8- 10],且表現(xiàn)為保護(hù)和毒害雙重作用,即低濃度H2O2則會誘導(dǎo)植物對逆境脅迫的抗性反應(yīng),提高植物的抗逆性,而高濃度H2O2會加速植物細(xì)胞的氧化損傷和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白交聯(lián),甚至誘導(dǎo)程序性死亡[8, 11- 12]。研究表明外源H2O2處理可以明顯緩解鋁毒對小麥幼苗根生長的抑制作用[12],調(diào)節(jié)脯氨酸代謝,增強(qiáng)甜玉米幼苗對銅脅迫的抗性[13]。外源H2O2處理種子可促進(jìn)淹水脅迫下大豆幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性,降低活性氧對細(xì)胞膜的損傷,提高植株的氣孔導(dǎo)度、凈光合速率和生物量[14]。H2O2葉面噴施處理明顯增強(qiáng)干旱脅迫下黃瓜幼苗植株體內(nèi)的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力,有效緩解細(xì)胞膜脂過氧化程度[15]。較低濃度H2O2預(yù)處理可以明顯提高鹽脅迫下人參植株的株高、光合色素含量以及干物質(zhì)量,而高濃度H2O2處理則會嚴(yán)重抑制人參植株生長[11]。此外,適宜濃度的H2O2預(yù)處理可明顯提高鹽脅迫下小麥幼苗中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性,增加谷胱甘肽和類胡蘿卜素含量[16]；提高綠豆幼苗體內(nèi)的抗壞血酸和谷胱甘肽含量,降低丙二醛(MDA)含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率,提高植株的耐鹽性[17]。也有研究表明H2O2處理可明顯增強(qiáng)鹽脅迫下草莓植株葉片中抗氧化酶、抗壞血酸和谷胱甘肽合成酶的表達(dá)水平,明顯提高光合能力[18]。我們的研究表明適宜濃度的H2O2可以提高水稻幼苗抗氧化能力,緩解Cd脅迫傷害[8]。

小白菜(BrassicachinensisL.)是深受人們喜愛的蔬菜之一。近年來隨著土壤鹽漬化程度的加重,使小白菜的萌發(fā)和生長受到明顯抑制,產(chǎn)量和品質(zhì)降低[19]。種子萌發(fā)期是小白菜生長周期的開始,在小白菜生長過程中至關(guān)重要,影響到后續(xù)幼苗的生長發(fā)育,而緩解鹽脅迫對小白菜種子在萌發(fā)過程中的傷害,有利于提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前有關(guān)H2O2在小白菜耐鹽方面的研究還未見報道。為此,本研究探討鹽脅迫下不同濃度的外源H2O2浸種處理對小白菜種子萌發(fā)、幼苗生長、膜脂過氧化、活性氧積累、抗氧化酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及幼苗Na+和K+選擇性吸收的影響,旨在探索利用外源H2O2來緩解鹽脅迫對作物的毒害,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用化學(xué)調(diào)控手段提高作物對鹽脅迫的耐受性提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小白菜品種為甜脆青(BrassicachinensisL. )F1 代,購于貴州貴豐種業(yè)有限公司。過氧化氫(30%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計與處理

1.2.1NaCl濃度的篩選

精選大小均一、籽粒飽滿的小白菜種子,0.5%的NaClO溶液消毒10 min,蒸餾水反復(fù)沖洗干凈,蒸餾水浸種2 h后,將浸種催芽后的種子分別播于鋪有雙層濾紙、含有不同濃度NaCl(0、50、100、150、200、250 mmol/L)的培養(yǎng)皿中,每皿播50粒種子。共6個鹽脅迫處理,每個處理5次重復(fù)。將種子統(tǒng)一置于(25±1)℃、相對濕度85%—90%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。種子培養(yǎng)期間,每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù),定時補(bǔ)充相應(yīng)的NaCl溶液,于培養(yǎng)7 d后計算其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),測定根長。

1.2.2H2O2浸種處理

根據(jù)1.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用100 mmol/L NaCl溶液處理小白菜種子。精選均一飽滿的健康小白菜種子,0.5%的NaClO溶液消毒10 min,蒸餾水反復(fù)沖洗干凈后,用濾紙小心的將小白菜種子表面水分吸干,分別用5、10、25、50和100 mmol/L H2O2溶液浸種2 h,同時以蒸餾水浸種處理2 h為浸種對照。將浸好的小白菜種子用蒸餾水沖洗3—5次后,用濾紙輕輕吸干種子上的殘留水分,然后將種子分別均勻播于鋪有兩層濾紙、含有100 mmol/L NaCl的培養(yǎng)皿中,每皿播50粒種子。以蒸餾水為對照,共7個處理,分別為：蒸餾水浸種非NaCl脅迫處理(CK)、蒸餾水浸種NaCl脅迫處理(NaCl)、5 mmol/L H2O2浸種NaCl脅迫處理(T1)、10 mmol/L H2O2浸種NaCl脅迫處理(T2)、25 mmol/L H2O2浸種NaCl脅迫處理(T3)、50 mmol/L H2O2浸種NaCl脅迫處理(T4)和100 mmol/L H2O2浸種NaCl脅迫處理(T5),每個處理重復(fù)5次。將種子統(tǒng)一置于相對濕度為85%—90%、溫度為(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)培養(yǎng)7 d。種子培養(yǎng)期間,每天觀察記錄發(fā)芽數(shù),定時補(bǔ)充NaCl溶液。種子培養(yǎng)7 d后,計算每個處理種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),測定每個處理中小白菜幼苗的胚根和胚芽的長度和鮮重。此外,各處理另設(shè)12個重復(fù)于培養(yǎng)7 d后取小白菜根和芽樣品用于相關(guān)生理指標(biāo)測定。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1種子萌發(fā)指標(biāo)測定

種子發(fā)芽以胚根長2 mm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn),小白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)計算參考楊波等[8],耐性指數(shù)和相對鹽害率參考李志萍等[20],公式如下：

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%

發(fā)芽勢(%)=(第3天的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%

發(fā)芽指數(shù)= ∑(t天的發(fā)芽數(shù)/相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))

活力指數(shù)=根長度×發(fā)芽指數(shù)

耐性指數(shù)(%)=活力指數(shù)處理/活力指數(shù)對照×100

根長相對鹽害率(%)=(對照根長-處理根長)/對照根長×100

1.3.2生長指標(biāo)測定

萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后,從每個處理中隨機(jī)選取15株幼苗,用游標(biāo)卡尺分別測定根和芽長度,計算平均長度,以cm表示；然后分別切取根和芽,采用萬分之一天平稱量鮮重,計算平均值,表示為mg/株。

1.3.3MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸法測定[21]。取0.1 g樣品,加入10% TCA迅速研磨,12000 g離心10 min后,取上清和10% TCA各2 mL于另一空離心管中,加蓋煮沸15 min,冰浴冷卻后再次3000 r/min離心10 min,取上清測定532、600 nm處的吸光值。

1.3.4H2O2含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率

H2O2含量測定參照鄒琦的方法[21],并稍作改動。取0.2 g樣品,加入2 mL預(yù)冷丙酮,充分研磨勻漿后,10000 r/min離心10 min,取1 mL上清液加入5%硫酸鈦和濃氨水,5000 r/min離心10 min 后,將沉淀溶于3 mL 1 mol/L的硫酸中,410 nm下測定吸光度。

1.3.5抗氧化酶活性測定

酶液的提取：取0.1 g樣品,放入預(yù)冷的研缽中,加適量預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液(含1% PVP、100 μmol/L EDTA、5 mmol/L DTT,pH 7.0),冰浴研磨成勻漿,在4℃下,12000×g 離心20 min。上清液即為酶待測液。

SOD(superoxide dismutase)采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法的測定[22],以抑制氯化硝基四氮唑藍(lán)光化還原50%為一個酶活性單位表示。POD(peroxidase)的測定采用愈創(chuàng)木酚比色法,以每1 min內(nèi)A470變化0.01為一個過氧化物酶活性單位[22]。CAT(catalase)的測定采用紫外吸收法,以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為一個酶活性單位[22]。APX(ascorbate peroxidase)的測定采用紫外吸收法法,以1 min內(nèi)A290減少0.01的酶量為一個酶活性單位[22]。

1.3.6脯氨酸和可溶性糖含量

采用酸性茚三酮顯色法測定[22]。取0.1 g樣品,加入3%磺基水楊酸研磨,沸水浴浸提10 min,冷卻后上清液即為脯氨酸的提取液,取2 mL上清液,加2 mL冰乙酸和3 mL 2.5%的酸性茚三酮,沸水浴顯色40 min,冷卻,加5 mL甲苯,振蕩30 s,靜置萃取,取上層溶液在520 nm處測定吸光度。

可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[22]。取0.2 g樣品,用80%酒精水浴中提取30 min,冷卻至室溫后4000 r/min 下離心10 min,上清液轉(zhuǎn)入至25 mL 容量瓶,反復(fù)浸提3次,合并上清液,定容至25 mL。取浸提液1 mL試液于試管,加入5 mL 蒽酮硫酸試劑,90℃水浴10 min,冷卻后在620 nm處測定吸光度。

1.3.7Na+和K+含量

Na+和K+含量的測定采用火焰光度計法測定。取0.1 g烘干樣品,加5 mL硫酸,沙浴2 h,然后用電熱板進(jìn)行消煮,每隔30 min 加入1 mL H2O2,直至混合液無色透明,然后用蒸餾水定容至50 mL,用火焰光度計法測定Na+和K+含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理,用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan方法進(jìn)行多重比較及差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05),圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對小白菜種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出,小白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根長均隨著NaCl脅迫濃度的升高而逐漸降低。與對照相比,高于150 mmol/L NaCl脅迫下,小白菜種子的發(fā)芽率明顯降低(P<0.05)；高于100 mmol/L NaCl脅迫顯著抑制小白菜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)(P<0.05)。不同濃度NaCl脅迫明顯抑制小白菜種子的活力指數(shù)和萌發(fā)幼苗的根長(P<0.05),與對照相比,在50、100、150、200和300 mmol/L NaCl處理下小白菜種子的活力指數(shù)分別降低了30.45%、54.26%、67.79%、79.89%和89.17%,根長分別降低了28.09%、47.12%、58.41%、68.58%和78.32%。綜合來看,100 mmol/L NaCl脅迫顯著抑制小白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),且對活力指數(shù)和根長的抑制程度約為50%,因此本試驗(yàn)選用100 mmol/L NaCl溶液作為小白菜種子鹽處理的脅迫濃度。

表1 不同濃度NaCl脅迫對小白菜種子萌發(fā)狀況的影響

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)

2.2 H2O2對NaCl脅迫下小白菜種子萌發(fā)的影響

由表2可以看出,單獨(dú)100 mmol/L NaCl處理對小白菜種子萌發(fā)率無明顯抑制作用(P>0.05),但明顯降低了小白菜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(P<0.05),分別較對照降低了7.74%、13.50%和54.26%。T1—T5處理均提高了NaCl脅迫下小白菜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),其中以T2處理的緩解NaCl脅迫效果最顯著(P<0.05),其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)比單獨(dú)NaCl處理分別提高了7.91%、14.67%和78.19%。由T1到T5處理,隨著H2O2處理濃度的增加,其對NaCl脅迫下小白菜種子萌發(fā)的緩解作用呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢,雖然T4和T5處理也提高了NaCl脅迫下小白菜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),然而與單獨(dú)NaCl處理相比并未達(dá)到差異顯著水平(P>0.05)。這些結(jié)果表明,H2O2可有效緩解NaCl脅迫對小白菜種子萌發(fā)的抑制作用,且存在濃度效應(yīng),T2處理緩解效果最為明顯(表2)。

表2 H2O2對NaCl脅迫下小白菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

Table 2 Effects of H2O2on germination percentage, germination potential, germination index and vigour index of pakchoi seeds under NaCl stress

處理Treatment發(fā)芽率Germination percentage/%發(fā)芽勢 Germination potential/%發(fā)芽指數(shù)Germination index 活力指數(shù)Vigor indexCK92.80±3.03a90.40±3.24a39.40±2.35a178.09±15.55aNaCl88.00±4.29a83.40±2.72b34.08±1.98c81.45±9.66dT190.20±3.68a87.80±3.54ab37.22±1.97bc117.78±10.71cT293.20±4.24a90.00±2.88a39.08±2.21ab145.14±13.28bT390.60±5.77a87.60±3.23ab37.79±1.88bc116.12±12.98cT489.20±2.88a86.40±3.15ab35.41±1.48bc97.60±10.98cdT588.40±3.56a85.80±2.74ab34.83±1.62c90.79±8.76d

CK：蒸餾水對照,Control；NaCl：100 mmol/L NaCl；T1：100 mmol/L NaCl+5 mmol/L H2O2； T2：100 mmol/L NaCl+10 mmol/L H2O2；T3：100 mmol/L NaCl+25 mmol/L H2O2；T4：100 mmol/L NaCl+50 mmol/L H2O2；T5：100 mmol/L NaCl+100 mmol/L H2O2

2.3 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽生長的影響

圖1結(jié)果表明單獨(dú)NaCl脅迫明顯降低了小白菜幼苗根的生長,根長僅為對照的52.88%(P<0.05)。與單獨(dú)NaCl處理相比,T1—T3處理明顯緩解了NaCl脅迫對根長的抑制,且根長表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢,其中以T2處理緩解效果最好,其根長比單獨(dú)NaCl處理高出55.23%(P<0.05),但仍明顯低于對照(P<0.05),僅為對照的82.08%。然而T4和T5處理的根長與單獨(dú)NaCl處理相比,無明顯差異(P>0.05)。單獨(dú)NaCl脅迫明顯抑制小白菜幼苗芽長(P<0.05)；與單獨(dú)NaCl處理相比,T1—T4處理不同程度的提高了NaCl脅迫下小白菜幼苗的芽長,其中以T2處理下芽長最大,比單獨(dú)NaCl處理高出18.53%(P<0.05),仍略低于對照。

單獨(dú)NaCl脅迫明顯降低了小白菜幼苗根和芽的鮮重(P<0.05)(圖1),根和芽鮮重僅為對照的65.55%和82.58%。與單獨(dú)NaCl處理相比,T1—T3處理明顯促進(jìn)了NaCl脅迫下小白菜根和芽鮮重的增加,其中以T2處理增加幅度最大,為單獨(dú)NaCl處理的1.34倍(P<0.05)和1.18倍(P<0.05)。T4和T5處理根和芽鮮重與單獨(dú)NaCl處理相比,無顯著差異(P>0.05)。

圖1 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根長、芽長、根鮮重與芽鮮重的影響Fig.1 Effects of H2O2 on length and fresh weight of root and shoot of pakchoi seedlings under NaCl stress不同小寫字母表示同一部位不同處理間差異顯著(P<0.05),下同；CK：蒸餾水對照,Control；NaCl：100 mmol/L NaCl；T1：100 mmol/L NaCl+5 mmol/L H2O2； T2：100 mmol/L NaCl+10 mmol/L H2O2；T3：100 mmol/L NaCl+25 mmol/L H2O2；T4：100 mmol/L NaCl+50 mmol/L H2O2；T5：100 mmol/L NaCl+100 mmol/L H2O2

2.4 H2O2對NaCl脅迫下小白菜耐鹽指數(shù)和相對鹽害率的影響

耐鹽指數(shù)反映種子萌發(fā)對鹽脅迫的耐受程度,根長相對鹽害率反映萌發(fā)后幼苗受脅迫的傷害程度[20]。從表3 中看出,100 mmol/L NaCl脅迫下,相對鹽害率最大,為47.12。由T1到T5處理,相對鹽害率呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢,且均低于單獨(dú)NaCl脅迫處理,并以T2處理的相對鹽害率最低,較單獨(dú)NaCl脅迫處理降低了62.16%,差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。與相對鹽害率相反,T1—T5處理不同程度的提高了NaCl脅迫下小白菜種子的耐鹽指數(shù),且T2處理提高幅度最大,是單獨(dú)NaCl脅迫處理的1.78倍,差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

表3 H2O2處理對NaCl脅迫下小白菜種子耐鹽指數(shù)和相對鹽害率的影響

2.5 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物,其含量可以反映植物在逆境脅迫下受傷害的程度。圖2結(jié)果表明,單獨(dú)NaCl脅迫導(dǎo)致小白菜幼苗根和芽中MDA含量明顯增加(P<0.05),且幼根中的MDA 含量大于幼芽,分別為對照的1.76倍和1.29倍。H2O2浸種處理降低了NaCl脅迫下根和芽中MDA含量,且隨著H2O2處理濃度的增加,根和芽中MDA含量呈現(xiàn)先降低后增加的變化。各H2O2處理相比,以T2處理中MDA含量最低,其根和芽中MDA含量比單獨(dú)NaCl處理分別降低了33.72%(P<0.05)和18.48%(P<0.05),但仍高于對照。

圖2 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中MDA含量的影響Fig.2 Effect of H2O2 on MDA content in root and shoot of pakchoi seedlings under NaCl stressMDA：丙二醛,Malonaldehyde

2.6 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗活性氧積累的影響

圖3 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中H2O2含量和產(chǎn)生速率的影響Fig.3 Effects of H2O2 on the H2O2 content and production rate in the seedlings of pakchoi under NaCl stressH2O2：過氧化氫,Hydrogen 超氧陰離子自由基,Superoxide anion free radical

2.7 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗抗氧化酶活性的影響

圖4結(jié)果表明,NaCl脅迫明顯提高了小白菜幼苗根和芽中SOD、POD和APX活性(P<0.05)。T1—T4處理進(jìn)一步提高了NaCl脅迫下小白菜根和芽中SOD和APX活性,其中T2處理下SOD和APX活性增幅最大,根和芽中SOD、APX活性分別較單獨(dú)NaCl處理增加了30.41%和32.68%、49.41%和30.92%。與SOD和APX活性相反,T1—T4處理明顯降低了NaCl脅迫下小白菜根和芽中POD活性(P<0.05),特別是T2處理,但均高于對照(P<0.05)。

NaCl脅迫明顯抑制了小白菜幼苗根和芽中CAT活性(P<0.05)。但T1—T4處理明顯提高了NaCl脅迫下小白菜根中CAT活性(P<0.05),與單獨(dú)NaCl處理相比,根中CAT活性增加了18.43%—49.41%；T1—T3處理明顯提高了NaCl脅迫下小白菜芽中CAT活性(P<0.05),與單獨(dú)NaCl處理相比,芽中CAT活性增加了16.46%—28.10%。

圖4 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中SOD、POD、CAT和APX活性的影響Fig.4 Effects of H2O2 on activities of SOD、POD、CAT and APX in root and shoot of pakchoi seedlings under NaCl stressSOD：超氧化物歧化酶,Superoxide dismutase；POD：過氧化物酶,Peroxidase；CAT：過氧化酶,Catalase；APX：抗壞血酸過氧化物酶,Ascorbate peroxidase

2.8 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑,能降低細(xì)胞的滲透勢,提高植物組織的持水力,保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),其含量的高低與植物的抗逆性密切相關(guān)[23]。圖5結(jié)果表明,NaCl脅迫下,小白菜幼苗根和芽中脯氨酸和可溶性糖含量均明顯增加(P<0.05),其中根中脯氨酸和可溶性糖含量的增加幅度較芽中大。T1—T4處理促進(jìn)了小白菜幼苗根和芽中脯氨酸和可溶性糖含量的進(jìn)一步增加(P<0.05),其中以T2處理下小白菜幼苗根和芽中脯氨酸和可溶性糖含量增加最大,分別比單獨(dú)NaCl處理高出24.85%和20.96%、24.01%和19.45%。

圖5 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig.5 Effects of H2O2 on the content of proline and soluble sugar in root and shoot of pakchoi seedlings under NaCl stress

2.9 外源H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中Na+、K+含量及K+/Na+的影響

由圖6可知,100 mmol/L NaCl脅迫下,小白菜幼苗根和芽中Na+含量明顯增加(P<0.05),伴隨著Na+含量的增加,K+含量及K+/Na+顯著下降(P<0.05)。T1—T4處理明顯降低了小白菜幼苗根和芽中Na+含量,而明顯增加了K+含量,同時提高了K+/Na+,特別是T2處理,小白菜幼苗根和芽中Na+含量較單獨(dú)NaCl脅迫分別降低了17.75%和18.82%,根和芽中K+含量分別提高了19.84%和31.98%,K+/Na+分別提高了44.28%和62.57%,差異顯著(P<0.05)。由此可知,一定濃度的H2O2可提高NaCl脅迫下小白菜體內(nèi)K+含量,降低Na+含量,進(jìn)而提高小白菜幼苗根和芽中K+/Na+,從而提高植物的耐鹽性。

圖6 H2O2對NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中Na+、K+含量和K+/Na+的影響Fig.6 Effects of H2O2 on the Na+ and K+ contents and K+/Na+ in root and shoot of pakchoi seedlings under NaCl stress

3 討論

鹽脅迫是制約植物生長發(fā)育的主要非生物脅迫之一,也是當(dāng)今制約農(nóng)作物生產(chǎn)的嚴(yán)峻環(huán)境問題[1],它可直接或間接通過影響植物的代謝活動,如細(xì)胞活性氧代謝失衡、生物大分子損傷、抑制光合和呼吸代謝等,進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育及最終產(chǎn)量[2, 11]。種子萌發(fā)及幼苗生長是植物生命周期的開始階段,鹽脅迫會使種子活力受到嚴(yán)重的影響[6]。本研究表明,不同濃度的NaCl脅迫不同程度的抑制了小白菜種子萌發(fā)特性(表1)。100 mmol/L的NaCl脅迫下小白菜的萌發(fā)雖然未受明顯影響,但種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯受到抑制(表1)。這與NaCl脅迫對番茄[24]和油菜[25]的影響結(jié)果相一致。此外,NaCl脅迫下小白菜根長明顯受到抑制(表1),可能與NaCl脅迫減少植物對水分的可利用性、離子毒害、抑制細(xì)胞的生長和分裂有關(guān)[2, 26]。

H2O2是活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個重要內(nèi)源信號分子,具有多種生理功能,在植物抵抗逆境脅迫起著重要作用。已有研究表明,H2O2預(yù)處理可以促進(jìn)鹽脅迫下小麥[16, 27]、燕麥[28]和羽衣甘藍(lán)[29]的生長。然而由于作物種類和處理方式的不同,緩解鹽脅迫的最適H2O2濃度也不同。本研究采用不同濃度外源H2O2處理種子,在100 mmol/L NaCl脅迫下小白菜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及根和芽的生長均有所提高(表2、圖1),且均表現(xiàn)為隨著H2O2處理濃度的提高先增加后降低的趨勢,有效緩解了NaCl脅迫對小白菜種子萌發(fā)和幼苗產(chǎn)生的傷害,提高種子和幼苗的耐鹽能力(表3),其中10 mmol/L H2O2緩解作用最為明顯。

在鹽脅迫下,植物細(xì)胞會發(fā)生滲透脅迫,植物通過積累各種有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來維持滲透平衡,保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu),提高自身耐受性[20]。脯氨酸是一種重要的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),具有多種生物功能,參與滲透調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)構(gòu)成、保護(hù)細(xì)胞膜完整性、穩(wěn)定酶和蛋白質(zhì)以及清除自由基[13, 15]。可溶性糖既是滲透調(diào)節(jié)劑,也是合成其他有機(jī)溶質(zhì)的碳架和能量的來源,還可在細(xì)胞內(nèi)無機(jī)離子濃度高時起保護(hù)酶類的作用。有研究表明鹽脅迫可以誘導(dǎo)番茄[10]、油菜[25]植物體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量的增加。Sun等研究表明H2O2處理可以提高干旱脅迫下黃瓜幼苗體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量,提高其抗干旱能力[15]。Wen等研究表明外源H2O2處理提高了Cu脅迫下玉米幼苗葉片中脯氨酸和可溶性糖含量,從而提高CuCl2脅迫下甜玉米幼苗根和芽的生長[13]。劉建新等研究發(fā)現(xiàn)外源H2O2通過活化脯氨酸合成的谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑,抑制脯氨酸的降解,促進(jìn)混合鹽堿脅迫下燕麥幼苗脯氨酸的積累[31]。本研究結(jié)果表明,在NaCl脅迫下,適宜濃度的H2O2浸種處理可以進(jìn)一步誘導(dǎo)小白菜根和芽中脯氨酸和可溶性糖含量的增加(圖5)。脯氨酸和可溶性糖含量增加可提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力,從而提高小白菜幼苗的耐鹽能力。

許多研究表明H2O2作為一種活性氧,在參與調(diào)節(jié)植物生理代謝和抗性反應(yīng)中具有明顯的濃度效應(yīng)。有研究表明1—5 mmol/L H2O2促進(jìn)鹽脅迫下水稻幼苗根系中APX、SOD和CAT活性的增加,但是10 mmol/L H2O2則降低其對抗氧化酶的促進(jìn)作用[30]。低濃度 H2O2處理促進(jìn)了鹽脅迫下人參根長、干物質(zhì)重、葉綠素和類胡蘿卜素含量,然而高濃度則產(chǎn)生明顯的抑制作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2通過提高小白菜幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性和游離脯氨酸含量,降低細(xì)胞膜質(zhì)過氧化作用,促進(jìn)萌發(fā)種子胚根和胚芽的生長。隨著H2O2處理濃度的增加,則緩解作用先增強(qiáng)后降低,以10 mmol/L的H2O2效果最好。

保持植物體及細(xì)胞內(nèi)的離子平衡對植物正常的生長至關(guān)重要。在鹽脅迫下植物通常吸收Na+的同時抑制K+吸收[32- 33]。本研究發(fā)現(xiàn),NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中K+含量顯著降低,Na+含量顯著增加,K+/Na+明顯低于對照(圖6)。研究認(rèn)為,植物耐鹽能力的強(qiáng)弱與Na+、K+的選擇性吸收密切相關(guān),限制Na+進(jìn)入體內(nèi),選擇性的吸收K+,才能提高其耐鹽能力[34]。本研究結(jié)果表明,外源H2O2可不同程度的提高NaCl脅迫下小白菜幼苗根和芽中K+含量,降低Na+含量,K+/Na+顯著增加(圖6)。K+/Na+離子平衡可能與H2O2處理提高鹽脅迫下小白菜幼苗抗氧化能力,減輕了細(xì)胞質(zhì)膜的損傷,維持了細(xì)胞膜的完整性,保護(hù)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)[6],從而提高了幼苗對Na+、K+選擇性吸收能力[33]。該結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,NaCl脅迫下外源H2O2浸種通過提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量,降低活性氧的積累及膜脂過氧化,維持K+/Na+離子平衡,緩解NaCl脅迫對小白菜幼苗細(xì)胞的傷害,促進(jìn)NaCl脅迫下小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長,其中10 mmol/L的H2O2效果最好。