氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留與安全性評價

朱曉丹，賈春虹，王 東，靖俊杰，賀 敏*

（北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097）

氟啶胺是日本石原產(chǎn)業(yè)自主研發(fā)生產(chǎn)的2,6-二硝基苯胺類低毒、廣譜性殺菌劑，對蔬菜及果樹上的許多病害都有一定的防治效果[1-3]。氟啶胺對疫病有特效，很多登記產(chǎn)品用于防治辣椒疫病、馬鈴薯和番茄晚疫病等[4-8]。蔥是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品蔬菜，在我國屬于小作物[9-10]。近些年隨著市場需要，蔥的種植面積不斷擴大，且復(fù)種指數(shù)增加，其病害發(fā)生情況逐年加重[11-13]。氟啶胺已廣泛用于蔥疫病的防治，但目前氟啶胺并未在蔥上登記使用[14]，且無食品安全限量標準指導(dǎo)生產(chǎn)和安全監(jiān)管，亟需開展氟啶胺在蔥上的殘留試驗，制定氟啶胺在蔥上的食品安全限量標準，保障農(nóng)產(chǎn)品安全和進出口貿(mào)易[15]。

關(guān)于氟啶胺的殘留與消解行為研究，國內(nèi)外已見報道的作物有辣椒、馬鈴薯、人參等[16-20]，其在不同作物上的殘留量差異較大。目前國內(nèi)外鮮見氟啶胺在大蔥或小蔥上的殘留報道。國內(nèi)外報道的關(guān)于氟啶胺的檢測分析方法有氣相色譜法[21-23]、液相色譜法[24-25]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[26-28]，涉及的基質(zhì)有蔬菜、水果和糧食作物，但鮮有涉及大蔥或小蔥。因此，本試驗開展氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留分析方法研究，并開展氟啶胺39.5%（體積分數(shù)）懸浮劑在大蔥和小蔥上的消解動態(tài)和最終殘留試驗，本研究結(jié)果可為氟啶胺在大蔥和小蔥上的安全合理使用技術(shù)、膳食攝入風(fēng)險評估和食品安全限量標準的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗地點和蔥品種：北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)榮各莊村的試驗蔥品種為‘北京高腳白’；山東省淄博市周村區(qū)南郊鎮(zhèn)柳行村的試驗蔥品種為‘章丘大蔥’；內(nèi)蒙古烏蘭察布市涼城縣麥胡圖鎮(zhèn)麥勝七隊的試驗蔥品種為‘春蔥一號’；江蘇省南京市溧水區(qū)百馬鎮(zhèn)江蘇省農(nóng)科院試驗基地的試驗蔥品種為‘小香蔥’；四川省彭州市濛陽鎮(zhèn)四川省農(nóng)科院植物高技術(shù)育種試驗基地的試驗蔥品種為小蔥；浙江省杭州市余杭區(qū)倉前鎮(zhèn)羊鍋林的試驗蔥品種為‘四季小蔥’。

甲酸（色譜純，純度89.5%）、氟啶胺標準品（純度99.6%） 百靈威科技有限公司；乙腈（色譜純，純度大于99.9%） 美國賽默飛世爾公司；氟啶胺39.5%（500 g/L）懸浮劑 日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司；0.22 μm濾膜 美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity-Xevo TQD超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（配備MassLynx V 4.1數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)）、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；2 mL凈化劑管（內(nèi)裝有無水硫酸鎂150 mg、N-丙基乙二胺50 mg、石墨化炭黑50 mg、十八烷基碳50 mg） 天津博納艾杰爾科技有限公司；2094樣品均質(zhì)機 丹麥FOSS公司；1/100 000和1/100電子天平 瑞士梅特勒-托利多集團；UMV-2多管漩渦混合器 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機、H1650-W高速離心機湖南湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 田間試驗

于2017年進行試驗。試驗設(shè)計參照NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗準則》[29]進行，分為最終殘留試驗和消解動態(tài)試驗2 個部分。試驗均設(shè)空白對照區(qū)、高劑量試驗區(qū)、低劑量試驗區(qū)、消解動態(tài)試驗區(qū)。采樣方法、樣品制備、貯存等按照《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》[30]執(zhí)行。

1.3.2 消解動態(tài)試驗

消解動態(tài)試驗僅在山東和四川兩地進行。動態(tài)試驗小區(qū)面積50 m2，另設(shè)清水噴霧對照區(qū)，各處理間設(shè)保護隔離區(qū)。于蔥苗長至20 cm高時開始施藥，施藥劑量為375 g/hm2（以有效成分計，下同），兌水噴霧蔥全株，每畝用水量約30～50 L，分別于施藥后1 h和1、3、7、14、21、28、35 d采用隨機的方法在試驗小區(qū)內(nèi)采集樣品。小區(qū)邊行和每行距離兩端0.5 m內(nèi)不采樣。

1.3.3 最終殘留試驗

設(shè)兩個施藥劑量：低劑量（250 g/hm2）和高劑量（375 g/hm2）。各設(shè)2 次施藥和3 次施藥兩個處理，每個處理設(shè)3 次重復(fù)，每小區(qū)15 m2。按照試驗設(shè)計時間開始第1次施藥，施藥間隔期為7 d。采樣時間為距離最后一次施藥間隔5、7、10、14 d。另設(shè)清水空白對照，各處理間設(shè)保護帶。

1.3.4 樣品采集、制備與保存方法

采用隨機的方法在試驗小區(qū)內(nèi)10 個以上的采樣點采集不少于1.0 kg的大蔥或小蔥樣品，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，帶回實驗室及時處理。樣品用不銹鋼刀切成1 cm左右的碎塊，在不銹鋼盆里充分混勻，四分法分取150～200 g樣品兩份，分別裝入封口樣品容器中，貼上標簽后于冰柜內(nèi)－20 ℃低溫保存，待用。

1.3.5 氟啶胺含量的分析

1.3.5.1 樣品的前處理

提取：稱取樣品10 g（準確至0.01 g）置于50 mL聚四氟乙烯試管中，加入20 mL乙腈溶液，漩渦振蕩提取3 min，再加入3.0 g氯化鈉，漩渦振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，待凈化。

凈化：將1.5 mL提取液轉(zhuǎn)入2 mL分散凈化管中，漩渦振蕩1 min，離心1 min，上清液過0.22 μm濾膜后，轉(zhuǎn)入預(yù)切口進樣小瓶待分析。

1.3.5.2 檢測條件

液相色譜條件：Acquity UPLC BEH C18不銹鋼柱，柱溫35 ℃，樣品室溫度15 ℃，進樣量3.0 μL。流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，流速0.3 μL/min。流動相梯度洗脫程序：0～3 min，流動相A由90%線性變化至10%；3～4 min，流動相A保持10%；4～5 min，流動相A由10%線性變化至90%。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離，毛細管電壓3.20 kV，離子源溫度150 ℃，去溶劑溫度400 ℃；去溶劑氣和錐孔氣均為高純液氮，去溶劑氣流速為700 L/h，錐孔氣流速為50 L/h；碰撞氣為高純氬氣；采用多反應(yīng)離子對監(jiān)測模式，以定量離子對、定性離子對和保留時間進行定性，以峰形好、干擾小、響應(yīng)高的定量離子對進行定量。氟啶胺的定量離子對、定性離子對、錐孔電壓、碰撞電壓、保留時間見表1。

表 1 檢測氟啶胺的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 UPLC-MS-MS conditions for fluazinam

1.3.5.3 標準曲線和添加回收率測定

取200 μL 1 000 mg/L氟啶胺母液，用乙腈定容到20 mL，配制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/L的標準溶液。用系列稀釋法配制質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的標準曲線系列。

取空白大蔥或小蔥樣品，按照1.3.5.1節(jié)方法進行試驗，凈化后的樣品為大蔥或小蔥基質(zhì)。用凈化后的大蔥或小蔥基質(zhì)稀釋氟啶胺母液，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/L的標準溶液作為母液，用系列稀釋法配制質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的大蔥或小蔥基質(zhì)標準曲線。

添加回收率測定：稱取空白大蔥和小蔥樣品，添加一定量的氟啶胺標準溶液，設(shè)定0.01、0.05、0.5 mg/kg 3 個添加量，每個添加量設(shè)置5 個重復(fù)，另設(shè)空白對照樣品（不添加氟啶胺）。

1.3.5.4 定量分析

本研究中檢測限（limit of detection，LOD）按照3 倍信噪比計算。

采用外標法定量，即用氟啶胺標準品（加入一定量的基質(zhì)）配成一系列標準溶液，以氟啶胺標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子對的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線y＝ax＋b，其中y為定量離子對的色譜峰面積，x為氟啶胺標準溶液質(zhì)量濃度，a為直線斜率，b為直線截距。本試驗中采集的大蔥或小蔥樣品的氟啶胺殘留量按式（1）計算。

式中：C表示氟啶胺殘留量/（mg/kg）；V為提取溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)（matrix effects，ME）按式（2）計算。

式中：B表示基質(zhì)標準曲線的斜率；A表示溶劑標準曲線的斜率。當(dāng)|ME|＜10%時，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，用溶劑標準曲線定量即可；當(dāng)10%＜|ME|＜50%時，有基質(zhì)效應(yīng)增強或減弱現(xiàn)象，用基質(zhì)標準曲線定量可適當(dāng)消除基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響；當(dāng)|ME|＞50%時，基質(zhì)效應(yīng)對定量的干擾較大，應(yīng)優(yōu)化樣品預(yù)處理方法使|ME|＜50%。

農(nóng)藥的消解趨勢用一級反應(yīng)動力學(xué)方程（式（3））計算。

式中：Ct表示時間t時的農(nóng)藥殘留量/（mg/kg）；Co表示施藥后作物上的原始沉積量/（mg/kg）；k表示消解系數(shù)；t表示施藥后時間/d。

半衰期（t1/2）表示農(nóng)藥殘留量消解一半所需要的時間，按式（4）計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線與基質(zhì)效應(yīng)

表 2 氟啶胺在不同基質(zhì)中的線性方程、相關(guān)系數(shù)、ME和LODTable 2 Calibration equations, correlation coefficients, ME and LOD for fluazinam in different substrates

如表2所示，氟啶胺在0.002～0.5 mg/L范圍內(nèi)能均呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。氟啶胺在大蔥和小蔥基質(zhì)中的ME分別為2.5%和6.2%，均小于10%，說明基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，用溶劑標準曲線定量即可。

2.2 定量分析方法的準確度、靈敏度和精密度

表 3 氟啶胺在大蔥和小蔥中的添加回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of fluazinam spiked into green Chinese onion and shallot

氟啶胺在大蔥和小蔥中的添加量分別為0.01、0.05、0.5 mg/kg時，回收率數(shù)據(jù)如表3所示。結(jié)果表明，氟啶胺在大蔥中的回收率為81.4%～107.0%之間，相對標準偏差為2.7%～4.6%；氟啶胺在小蔥中的回收率為99.0%～111.1%之間，相對標準偏差為1.5%～3.1%，滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.3 氟啶胺在大蔥和小蔥上的消解動態(tài)分析結(jié)果

圖 1 氟啶胺在大蔥（A）和小蔥（B）上的消解曲線Fig. 1 Degradation curves of fluazinam in green Chinese onion (A) and shallot (B)

如圖1所示，氟啶胺在山東大蔥上的原始沉積量為1.313 mg/kg，其消解規(guī)律符合一級動力學(xué)模型，消解方程為C＝2.286 8e－0.593t，相關(guān)系數(shù)r＝0.956 6，7 d消解率約為96.1%，半衰期t1/2＝1.2 d。氟啶胺在四川小蔥上的原始沉積量為3.265 mg/kg，其消解規(guī)律符合一級動力學(xué)模型，消解方程為C＝3.587 3e－0.08t，相關(guān)系數(shù)r＝0.977 9，35 d消解率約為94.4%，半衰期t1/2＝8.7 d。

氟啶胺39.5%懸浮劑噴霧在大蔥和小蔥上原始沉積量和降解半衰期差異明顯，大蔥上的原始沉積量遠小于小蔥，且在大蔥上降解比在小蔥快，這主要與大蔥和小蔥地上部分生物量不同有關(guān)[31-32]。

2.4 氟啶胺在大蔥和小蔥中的最終殘留量分析結(jié)果

于北京、山東、內(nèi)蒙古試驗點共采集144 個大蔥樣品，江蘇、四川、浙江試驗點共采集144 個小蔥樣品（不包括空白樣品），氟啶胺在大蔥和小蔥上的最終殘留情況見表4。

表 4 氟啶胺在大蔥和小蔥上的最終殘留量Table 4 Final residues of fluazinam in Chinese green onion and shallot

北京、山東和內(nèi)蒙古的所有大蔥樣品氟啶胺最終殘留量為＜0.010～0.400 mg/kg，采收間隔期5、7、10、14 d時，其最高殘留量分別為0.308、0.400、0.118、0.045 mg/kg，殘留量中值分別為0.139、0.068、0.012、0.015 mg/kg。江蘇、四川和寧夏的所有小蔥樣品氟啶胺最終殘留量為0.100～5.738 mg/kg，采收間隔期5、7、10、14 d時，其最高殘留量分別為5.738、5.018、3.334、4.909 mg/kg，殘留量中值分別為3.347、2.006、1.502、1.030 mg/kg。

本試驗中，氟啶胺在大蔥上使用后的殘留量遠低于小蔥，與氟啶胺在大蔥和小蔥上的消解趨勢基本吻合。大蔥的植株個體大、生長快、生物稀釋作用強。等量的氟啶胺噴霧到大蔥上后，其在大蔥上的原始沉積量低于小蔥，多次施藥后，其最終殘留量比小蔥低。理論上，隨著施藥次數(shù)增多、施藥量增加、采收間隔期縮短，大蔥和小蔥上氟啶胺的殘留濃度會逐漸增加[33]。但是在蔥的種植過程中，因為蔥的品種、植株大小、種植地的氣候條件、土壤質(zhì)地、有機質(zhì)含量、微生物群落等差異，導(dǎo)致不同試驗地點的樣品中氟啶胺的殘留量不同，且其殘留量的增減規(guī)律與理論值有一定差距，符合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實際情況[34-35]。

歐盟、日本、韓國規(guī)定氟啶胺在蔥上的最大殘留限量分別為0.01、0.1、3.0 mg/kg，中國、國際食品法典委員會、美國、加拿大和澳大利亞均未規(guī)定氟啶胺在蔥上的食品安全限量標準。參照韓國的限量標準，采收間隔為14 d時，氟啶胺在大蔥上的殘留量是安全的，江蘇和四川收獲的小蔥樣品中氟啶胺的殘留量是安全的，但是寧夏的小蔥樣品中氟啶胺的殘留量高于3.0 mg/kg，食用不安全。參照歐盟的限量標準，我國大蔥和小蔥上氟啶胺的殘留都不安全。參照日本的限量標準，大部分大蔥和小蔥樣品中氟啶胺的殘留都不安全。大蔥和小蔥是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品蔬菜，在日常烹飪中經(jīng)常會用到，但是它們作為膳食的攝入量并不大，完全依據(jù)國外的限量標準評判氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留安全性可能并不合適[36]，我國應(yīng)加快制定氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留限量標準，保障食品安全。

3 結(jié) 論

本研究建立了氟啶胺在大蔥和小蔥上的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，方法的靈敏度、準確度、精密度符合農(nóng)藥殘留分析的要求。開展了氟啶胺39.5%懸浮劑在大蔥和小蔥上的消解動態(tài)和最終殘留試驗，結(jié)果表明，氟啶胺在大蔥和小蔥上的消解速度很快，降解半衰期分別為1.2 d和8.7 d。低劑量（250 g/hm2）和高劑量（375 g/hm2）施藥2～3 次，施藥間隔7 d，采收間隔期5、7、10、14 d時，收獲的大蔥中氟啶胺的殘留量為＜0.010～0.308 mg/kg，小蔥中氟啶胺的殘留量為0.100～5.738 mg/kg。我國未制定氟啶胺在大蔥和小蔥上的食品安全限量標準，歐盟、日本、韓國規(guī)定氟啶胺在蔥上的限量標準分別為0.01、0.1、3.0 mg/kg。根據(jù)本試驗結(jié)果，參照國外的限量標準評判氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留安全性過于嚴格，我國應(yīng)加快制定氟啶胺在大蔥和小蔥上的殘留限量標準。