羊肉火腿加工過程中粗肽抗氧化活性

王勇勤，郭 新，馬雪蓮，袁湖川，朱苗苗，黃笠原，王 遠，王慶玲,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.新疆農墾科學院，新疆 石河子 832000）

新疆羊肉因其高蛋白、低脂、低膽固醇深受各族人民喜愛[1]。羊肉火腿是以新疆羊后腿為原料，經過腌制、發酵、成熟獲得的具有特征香氣的特色食品。研究表明在傳統火腿生產加工過程中，蛋白質發生復雜變化，產生小分子肽和氨基酸等物質[2]；還有學者在對火腿的研究中發現蛋白質降解產生了具有抗氧化能力的肽類物質[3-6]。

天然抗氧化肽在減少細胞氧化、防止脂質過氧化、降低自由基生成速率等方面具有重要作用[7]，并在人體新陳代謝方面也發揮調節功能[8]。與人工合成抗氧化劑相比，天然抗氧化肽具有分子質量小、易消化、無副作用等優勢[9]。馬艷梅[10]對新疆綿羊火腿蛋白質降解的研究表明，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在加工過程中發生不同程度的降解，產生大量的游離氨基酸，生成羊肉火腿獨特的前體風味物質。王勇勤等[11]研究了羊肉火腿加工中抗氧化體系的動態變化，證明脂溶性內源抗氧化物在羊肉火腿加工中發揮重要作用。然而，目前對羊肉火腿加工過程中抗氧化肽的研究甚少，關于抗氧化肽對羊肉火腿脂質氧化的調控作用尚未明確。

基于此，本研究以不同加工時期的羊肉火腿為研究對象，提取粗肽并對其含量進行測定，繼而對抗氧化能力進行表征和評價，以期獲得羊肉火腿中抗氧化肽的抗氧化能力變化規律，為進一步研究粗肽對脂質氧化的調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆塔城巴什拜羊后腿，畜齡12 個月，購于石河子市農貿市場。

鄰二氮菲、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、水溶性VE（Trolox）、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxyltoluene，BHT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-2000E旋轉蒸發器 西安儀貝爾儀器設備有限公司；X7型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；DCodeTMSystem蛋白電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肉火腿加工工藝

1.3.1.1 羊肉火腿工藝流程

新鮮羊后腿→預冷修整→加鹽腌制→洗刷浸泡→晾曬風干→晾掛發酵→成熟→羊肉火腿[11]

1.3.1.2 工藝條件

參考Wang Zhenyu等[12]研究方法并略作修改。原料腿：4 ℃放置48 h預冷；腌制期：添加質量分數6.5%（以鮮腿質量計）食鹽腌制，分5 次揉搓于原料表面，于6 ℃、相對濕度（relative humidity，RH）65%條件下腌制30 d；風干期：10 ℃、RH 62%，風干30 d；發酵期：20 ℃、RH 72%，發酵60 d；成熟中期：25 ℃、RH 78%，成熟30 d；成熟結束期：28 ℃、RH 70%，后熟65 d。

1.3.2 取樣時間

于原料腿、腌制期、風干期、發酵期、成熟期、成熟中期、成熟結束期6 個工藝點分別取樣，對應取樣時間點分別為0、30、60、120、150、180 d，樣品真空包裝后冷凍保藏備用。

1.3.3 羊肉火腿粗肽及粗蛋白的提取

參照Zhu Chaozhi等[13]研究方法并略作修改。去除羊肉火腿樣品中脂肪、肌膜，將其剪碎，稱取5.0 g加入15 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），勻漿3 次，每次10 s。勻漿液于4 ℃下冷藏20 min，離心40 min（4 ℃、6 500 r/min）；取上清液加入3 倍體積的體積分數40%乙醇溶液，4 ℃下冷藏12 h后，4 ℃、6 500 r/min離心35 min，收集上清液；沉淀物重復上述操作步驟，合并上清液，冷凍干燥12 h制得粗肽粉，－20 ℃冷凍備用。火腿粗蛋白的提取按照上述方法，不進行體積分數40%乙醇溶液沉淀及之后的操作。

1.3.4 多肽質量分數的測定

參照Church等[14]研究方法并略作修改。20 mg鄰苯二甲醛溶于0.5 mL甲醇，加入12.5 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、1.25 mL 0.2 g/mL SDS、50 μLβ-巰基乙醇、100 μL 1 mg/mL粗肽溶液混合（現配現用）定容至25 mL，得粗肽混合液。取0.1 mL粗肽混合液與1.0 mL 0.8 mg/mL鄰苯二甲醛溶液混合，室溫下反應2 min，于340 nm波長處測定吸光度（A340nm）。用胰酪蛋白胨作標準物配制標準蛋白質溶液，以蛋白質量濃度為橫坐標，以A340nm為縱坐標繪制標準曲線，所得線性回歸方程為Y＝0.528 7X＋0.193 8（R2＝0.993 6）。多肽質量分數按式（1）計算。

式中：ρ為粗肽溶液中多肽質量濃度/（mg/mL）；V為稀釋體積/mL；m為粗肽粉質量/mg。

1.3.5 還原力的測定

參考Remanan等[15]研究方法并略作修改。將1.0 mL粗肽液（5 mg/mL）、1.0 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液和1 mL PBS（0.2 mol/L）混合，40 ℃水浴孵育30 min后冰水冷卻，加入1.0 mL體積分數10%的三氯乙酸溶液混勻，4 500 r/min離心30 min。上清液加入2.5 mL蒸餾水、0.2 mL 0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液充分反應15 min，于700 nm波長處測定吸光度，平行測定3 次。

1.3.6 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

參考Floegel等[16]研究方法，略作修改。將7 mmol/L ABTS溶液、2.45 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，生成ABTS陽離子自由基，用去離子水與無水乙醇混合液（1∶1，V/V）將其稀釋13 倍（試劑需現配現用）。取20 μL粗肽液（3 mg/mL），加入80 μL去離子水和100 μL稀釋的ABTS溶液于酶標板中避光反應10 min，于734 nm波長處測定吸光度（A734nm）。以A734nm為縱坐標，以Trolox濃度為橫坐標繪制標準曲線，所得線性回歸方程為Y＝－2.543 3X＋0.407 9（R2＝0.997 9，線性范圍0～0.16 mmol/L），將所測樣品A734nm代入標準曲線方程計算ABTS陽離子自由基清除能力，結果以每毫升溶液中Trolox的物質的量表示。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的測定

參考Sheih等[17]研究方法并略作修改。取80 μL粗肽液（3 mg/mL）與100 μL DPPH自由基溶液（0.2 mmol/L），加入酶標板中室溫避光反應25 min，于517 nm波長處測定吸光度。以A517nm為縱坐標，以Trolox濃度為橫坐標繪制標準曲線，所得線性回歸方程為Y＝－3.008 8X＋0.478 3（R2＝0.998 6，線性范圍0～0.16 mmol/L）。將所測樣品A517nm代入標準曲線方程計算DPPH自由基清除能力，結果以每毫升溶液中Trolox的物質的量表示。

1.3.8 羥自由基清除率的測定

參照Zhu Chaozhi等[13]研究方法并略作修改。將0.7 mL PBS（0.2 mol/L）、1.0 mL鄰二氮菲（5 mmol/L）、1.0 mL乙二胺四乙酸（pH 7.4）、1.0 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵溶液及1.4 mL體積分數1%的H2O2溶液加入1.0 mL粗肽液（5 mg/mL）中，30 ℃恒溫孵育1.5 h，于536 nm波長處測定吸光度，記為A樣品；用去離子水代替H2O2溶液重復上述步驟測定吸光度，記為A未損傷；用去離子水代替粗肽液重復上述步驟測定吸光度，記為A損傷[12]。羥自由基清除率按式（2）計算。

1.3.9 脂質氧化抑制率的測定

參照Jayaprakasha等[18]研究方法并略作修改。配制不同質量濃度（5、10、15、20、25 mg/mL）粗肽溶液，考察粗肽溶液質量濃度對脂質氧化抑制率的影響。將0.48 g亞油酸、0.048 g吐溫20溶于PBS（0.2 mol/L），PBS定容至50 mL配得亞油酸乳化液。將1.0 mL無水乙醇、5.0 mL亞油酸乳化液、4.0 mL 0.2 mol/L PBS與4.0 mL不同質量濃度粗肽液混合。0.1 mL混合液與4.7 mL體積分數70%的乙醇溶液、0.1 mL 30 g/100 mL硫氰酸銨溶液混勻后加入0.1 mL 0.02 mol/L氯化亞鐵溶液反應5 min，于500 nm波長處測定吸光度，記為A樣品0h，間隔120 h后測吸光度，記為A樣品120h。空白對照：用去離子水代替粗肽液重復上述步驟測定吸光度，記為A空白0h，間隔120 h后測吸光度，記為A空白120h。脂質氧化抑制率按式（3）計算。

1.3.10 SDS-PAGE分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）參照汪家政[19]的方法并略作修改。將100 μL蛋白粗提液（1 mg/mL）加入100 μL 5×樣品緩沖溶液中，100 ℃恒溫孵育10 min，冷卻，立刻上樣。SDS-PAGE條件：分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為5%，電泳起始電壓80 V，樣品進入分離膠后電壓調至160 V，考馬斯亮藍染色35 min，脫色后于凝膠呈像儀上呈像觀察。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 羊肉火腿加工過程中粗肽中多肽質量分數的變化

圖 1 羊肉火腿加工過程中多肽質量分數的變化Fig. 1 Changes in peptide content during mutton ham processing

由圖1可知，隨著加工的進行，羊肉火腿中多肽質量分數總體呈增長趨勢。從原料腿到腌制期多肽質量分數由8%增至9%，變化不顯著（P＞0.05）。其原因可能在于低溫腌制（4 ℃）過程中羊肉火腿的內源蛋白酶活力受到一定程度的抑制，繼而抑制蛋白質水解。腌制期到成熟中期，火腿中多肽質量分數顯著增高歸因于加工溫度的升高對內源蛋白酶的激活作用，加速了蛋白質向多肽分子的轉化，同時，在二肽酶等蛋白酶作用下多肽分子繼續水解為小肽和游離氨基酸[20]。從成熟中期至成熟結束期多肽質量分數大幅升高，火腿成品多肽質量分數高達63.32%，究其原因可能與火腿成熟后期的溫度升高有關。Zhou Guanghong等[21]在金華火腿的加工中同樣發現多肽含量在發酵期至成熟期迅速增加的現象。在火腿加工過程中，肌肉蛋白質在內源酶和微生物作用下水解產生大量多肽片段和小分子肽類等物質，并隨著加工過程而逐漸累積[22]。

2.2 羊肉火腿加工過程中粗肽還原力的變化

還原力是以Fe3＋被抗氧化物還原后在700 nm波長處的吸光度來表征[23]。對火腿加工過程中的粗肽還原力測定結果如圖2所示。

圖 2 羊肉火腿加工過程中粗肽還原力的變化Fig. 2 Changes in reducing power of crude peptides during mutton ham processing

由圖2可知，火腿加工過程中粗肽還原力隨加工時間延長呈上升趨勢，原料腿的粗肽還原力低于此后各個加工時期，成熟結束期A700nm高達0.45，表明羊肉火腿在加工過程中粗肽抗氧化能力逐漸增強并在成熟結束期達到峰值。產生這種現象的主要原因可能是隨加工時期溫度的增加，食鹽不斷向肌肉內部浸入，加速蛋白結構的破壞和分解，繼而大量產生抗氧化肽小分子[20]。與Mora等[24]對帕爾瑪干腌火腿的研究結果相比，羊肉火腿粗肽的還原力較低，原因可能在于原料及加工工藝的不同所致，帕爾瑪火腿腌制發酵時間遠長羊肉火腿，長時間的腌制發酵可能產生更多的抗氧化肽，同時帕爾瑪火腿加工過程中會在火腿表面涂抹豬脂，以防止內部脂質氧化，進而增加了抗氧化肽的積累，表現出更強的還原力。

2.3 羊肉火腿加工過程中粗肽ABTS陽離子自由基清除能力的變化

由圖3可知，羊肉火腿加工中ABTS陽離子自由基清除能力總體呈上升趨勢，并在成熟結束期達到最大。羊肉火腿腌制期粗肽ABTS陽離子自由基清除能力為0.04 mmol/L，低于原料腿粗肽，從腌制期至發酵期粗肽抗氧化能力上升，說明此階段抗氧化物生成速率大于氧化速率[25]；至成熟中期粗肽ABTS陽離子自由基清除能力急劇下降，主要原因可能是成熟期抗氧化物參與化學反應生成了揮發性風味物質，使抗氧化物轉化為風味化合物，從而表現出抗氧化能力降低的現象[26]。羊肉火腿在成熟中期和成熟結束期分別呈現最低和最高的ABTS陽離子自由基清除能力，此階段變化最為顯著（P＜0.05），上升幅度約200%。產生此現象的原因可能是蛋白酶活力逐漸增強，加快了蛋白質向抗氧化肽和氨基酸的轉化速率[27]，因此增強了粗肽抗氧化能力和ABTS陽離子自由基清除能力。

圖 3 羊肉火腿粗肽對ABTS陽離子自由基清除效果Fig. 3 Scavenging effect of crude peptides from mutton ham on ABTS cation radicals

2.4 羊肉火腿加工過程中粗肽DPPH自由基清除能力的變化

DPPH自由基清除能力可以用來表征物質的抗氧化能力[28]。由圖4可知，火腿加工過程中粗肽DPPH清除能力呈現不規則波動，整個工藝中，腌制期和成熟中期表現出較強的DPPH自由基清除能力，可能是由于在腌制期和成熟中期蛋白質水解程度大，疏水性小分子多肽含量增多，因而對DPPH自由基親和能力增強[29]。從原料腿到腌制期粗肽DPPH自由基清除能力大幅上升，可能是由于食鹽對蛋白質水解的加速作用，促使含有抗氧化基團的小肽大量生成；腌制結束后呈現的持續下降主要歸因于含有色氨酸、酪氨酸的抗氧化肽進一步氧化的結果[30]。

2.5 羊肉火腿加工過程中粗肽羥自由基清除率的變化

羥自由基可以與食品中脂質和蛋白質分子發生生化反應，進而影響食品的貨架期和品質[31]。由圖5可知，羊肉火腿加工過程中羥自由基清除率整體呈下降趨勢（P＜0.05），成熟結束期粗肽羥自由基清除率最低（15.23%），而風干期呈最大值（65.17%）。風干期粗肽羥自由基清除率顯著上升（P＜0.05），這是由于此時火腿經過腌制、風干致使原料腿中水分大量散失，一些小分子多肽和氨基酸類物質富集，濃度升高，從而表現出較高的羥自由基清除率。但在風干期結束后由于抗氧化物質羥自由基清除活性較低[32]、氧化反應生成其他產物或生成大量揮發性風味物質[33]，因而羥自由基清除率呈現下降趨勢。此結果與胡亞亞等[23]對金華火腿的研究結果略有差異，主要原因是金華火腿在加工過程中經過自然晾曬并有長達1 年甚至3 年的發酵期，使火腿內部蛋白質充分降解成具有抗氧化能力的小分子多肽和游離氨基酸；此外，羊肉火腿加工過程中關鍵工藝參數與金華火腿也有較大差異，如溫、濕度和腌制時間，因此共同導致了抗氧化能力的差異。

圖 5 羊肉火腿加工中粗肽羥自由基清除率的變化Fig. 5 Changes in hydroxyl radical scavenging rate of crude peptides during mutton ham processing

2.6 羊肉火腿加工過程中粗肽液脂質氧化抑制率的變化

圖 6 羊肉火腿加工過程中粗肽液脂質氧化抑制率的變化Fig. 6 Changes in anti-lipid oxidation activity of crude peptides during mutton ham processing

考察不同加工時期羊肉火腿粗肽脂質氧化抑制率，并與相同質量濃度的GSH、BHT進行對比，由圖6可知，原料腿和腌制期粗肽液的脂質氧化抑制率明顯低于GSH和BHT（圖6A、B），可能是由于在原料腿和腌制期羊肉火腿水分含量較高，食鹽未完全滲透至火腿內部以及發酵溫度較低，此時蛋白質水解程度小，抗氧化物或潛在抗氧化物質生成較少[34]；風干期和發酵期羊肉火腿粗肽液質量濃度分別高于25、15 mg/mL時，脂質氧化抑制率高于BHT但低于GSH（圖6C、D），此時羊肉火腿蛋白質在微生物酶和食鹽的協同作用下加速分解生成具有抗氧化力的多肽[20]；成熟中期脂質氧化抑制率表現為GSH＞粗肽液＞BHT，當質量濃度為25 mg/mL時粗肽液脂質氧化抑制率為93.6%，抑制效果顯著高于BHT（P＜0.05）（圖6E）。成熟結束期羊肉火腿粗肽液（5～20 mg/mL）的脂質氧化抑制率與GSH相當，且顯著高于BHT（P＜0.05）（圖6F），說明羊肉火腿成品具有較強的抗氧化能力，此結果與邵靖萱等[35]對宣威火腿加工過程中抗氧化肽活性的研究結果相似。以上結果表明：羊肉火腿各加工時期粗肽液、GSH和BHT的脂質氧化抑制率均隨質量濃度的增加而升高；羊肉火腿加工過程中粗肽液抗氧化能力不斷增強，至成熟結束期其抗氧化能力與GSH相當。

2.7 羊肉火腿加工過程中蛋白質變化規律

圖 7 羊肉火腿加工中蛋白質分解的變化Fig. 7 Changes in protein breakdown during mutton ham processing

由圖7可知，羊肉火腿加工過程中主要蛋白質包括肌鈣蛋白（73 kDa）、肌鈣蛋白T（37 kDa）、磷酸甘油酸酯激酶（35 kDa）、原肌球蛋白（31 kDa）等。加工過程中肌肉蛋白發生了一定程度的降解，肌鈣蛋白T從腌制期開始蛋白條帶逐漸加深，表明在腌制階段肌肉蛋白質的降解就已經逐步發生，可能發酵過程中溫度上升，組織蛋白酶活力增強，從而加快了肌原纖維蛋白降解速率[27]。原肌球蛋白從原料腿開始蛋白條帶逐漸變淡，表明原肌球蛋白分子從加工開始就出現降解，至火腿成熟結束條帶顏色甚微，其原因可能是長時間加工過程中蛋白分子在食鹽、溫度、濕度條件共同作用下，導致原肌球蛋白變性、降解，生成小分子肽，此類小分子肽一般具有較好的抗氧化性能，同時能參與其他化學反應，生成賦予火腿良好感官品質的物質[36]。此外，分子質量62、48、41、24 kDa的蛋白質條帶也發生降解。有研究表明，金華火腿在發酵過程中蛋白質發生顯著降解，小分子多肽數量會逐漸增加[37]，多肽組成可分為5 個分子質量范圍，即160～375、375～500、500～1 200、1 200～2 700 Da和2 700～4 500 Da；同時，當火腿多肽氨基酸序列為Ser-Asn-Ala-Ala-Cys和Asp-Leu-Glu-Glu時抗氧化活性較強[38]。

3 結 論

通過對羊肉火腿加工過程中粗肽的多肽質量分數、還原力、羥自由基清除率、脂質氧化抑制率、抗氧化能力進行測定，結果表明：原料腿到成熟中期粗肽粉中多肽質量分數逐漸升高，還原力隨加工時間延長而增加；多肽抗氧化能力整體呈上升趨勢，羥自由基清除率整體呈下降趨勢；隨粗肽液質量濃度升高，脂質氧化抑制作用逐漸增強。SDS-PAGE結果顯示，火腿加工過程中伴隨著不同程度的蛋白質分子降解。綜上表明新疆羊肉火腿在加工過程中蛋白質發生了一系列生化反應，并對羊肉火腿抗氧化功能產生重要影響。