黃原膠對體外模擬消化過程中4 種竹葉黃酮生物可及性的影響

李占明，蔡泓歷，梁 奕，毛 豪，廖晗雪，俞 玥*，周冬仁

（1.中國計量大學生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.浙江省農業科學院食品科學研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省淡水水產研究所，浙江省漁業健康與營養重點實驗室，浙江 湖州 313001）

現有研究表明，植物來源的天然抗氧化物質能夠有效干預氧化應激，對相關疾病的預防具有重要意義，是當前天然活性物質開發研究領域的熱點問題[1-3]。植物黃酮類膳食補充劑的攝入對于維持和促進人體生理健康具有積極意義[4-5]。研究證實，谷物黃酮可以明顯抑制由脂質體引起的細胞炎癥，發揮抗炎作用[6]。同時，植物黃酮還可以通過介導細胞凋亡來實現其對氧化損傷的保護作用[7]。生物可及性是指生物活性物質在攝入之后能被機體吸收的比例，然而，植物黃酮在胃腸道消化中易被降解，導致生物可及性降低，這限制了其生物活性的發揮[8-9]。生物可及性的提高使活性物質得以進入循環系統，發揮其生物活性[10]。因此，提高植物來源的黃酮類抗氧化物質的生物可及性對其產品開發及生物活性的利用至關重要。

植物來源的竹葉碳苷黃酮是黃酮類抗氧化劑，因其具有抗炎、抗輻射、抗腫瘤等良好的生物活性，近年來引起廣泛關注[11]。據報道，來源于金剛竹的竹葉抗氧化提取物中主要的標志性碳苷黃酮為葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素[12-13]。近來，針對竹葉碳苷黃酮的研究大多集中在其粗提物的抗氧化活性等方面[14-15]，鮮有研究關注其經胃腸道消化后的生物可及性。含碳苷黃酮的食物進入口腔，經胃腸消化后，剩余部分得以達到小腸壁，然后經被動運輸進入循環系統[16-17]，在消化過程中，不同消化階段消化液pH值的變化加劇了黃酮的降解[18-19]。目前關于提升膳食黃酮類物質生物可及性的研究有待深入開展。

體外模擬消化模型的應用有助于減少實驗動物的使用，便于在體外進行相關的物理、化學特性研究。相較于體內消化研究，體外模擬消化模型具有操作便利、避免倫理學沖突、低成本、快速等特點，因此，近年來得到了大量的關注[20-21]。同時，研究表明，纖維素可以用來提升植物活性物質生物可及性。纖維素與生物活性物質經過物理包覆后，其在消化過程中的降解大大減少，此外，膳食纖維的加入有助于降低胃腸道消化液的通過速度，減少生物活性物質的損失[22-23]。本課題組在前期研究中發現，相較于添加羧甲基纖維素鈉、支鏈淀粉、阿拉伯膠等物質，在模擬腸道消化時，添加黃原膠有助于提升竹葉黃酮的生物可及性。鑒于此，本實驗構建體外模擬消化模型，系統探究黃原膠對4 種竹葉碳苷黃酮生物可及性的提升作用。同時，采用主成分分析和聚類分析研究不同的消化液消化階段添加黃原膠后，4 種碳苷黃酮生物可及性的聚類趨勢及不同碳苷黃酮質量濃度變化的線性關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉 浙江圣氏生物科技有限公司；4 種竹葉黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素）標準品為實驗室自制（純度均大于98%）。

黃原膠、α-淀粉酶、膽酸鈉 上海阿拉丁試劑有限公司；福林-酚試劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Synergy H2多功能酶標儀、離心機 美國Biotek公司；Acquity超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）系統 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 竹葉碳苷黃酮提取物的制備

干燥竹葉（PhyllostachysSiet. et Zucc leaf）經粉碎機粉碎后，用體積分數80%的乙醇溶液在持續攪拌下提取3 h[24]，提取物濃縮后進行噴霧干燥，得到竹葉提取物粉末，干燥粉末經水溶解，8 000×g離心10 min后的溶液用于總酚、總黃酮含量的測定及體外模擬消化實驗。

1.3.2 總酚含量的測定

總酚含量的測定依據福林-酚法[25-26]。配制0.1 mg/mL沒食子酸工作溶液。將不同體積（0、20、40、60、80、100、120 μL）的沒食子酸工作溶液加入離心管中，然后加入40 μL福林-酚試劑，再加入質量分數為12%的碳酸鈉溶液80 μL，用去離子水將反應液總體積補足至1 mL，暗處反應2 h后，將反應液加入酶標板，每個質量濃度4 個重復，在765 nm波長處測定溶液的吸光度，制作標準曲線，依據標準曲線計算總酚的含量，結果以每克干物質中沒食子酸當量表示。

1.3.3 總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定依據文獻[27-28]的方法，以兒茶素為標準品，依據標準曲線進行計算，結果以每克干物質中兒茶素當量表示。

1.3.4 體外消化模型的建立

本研究的消化對象為未經消化的20 mg/L竹葉碳苷黃酮提取物（原始樣品）、竹葉碳苷黃酮提取物與黃原膠混合液（兩者質量濃度分別為20、16 mg/L）（黃原膠保護組）和20 mg/L竹葉碳苷黃酮提取物（直接消化組）。原始樣品不做消化處理，作為對照品；將黃原膠保護組、直接消化組經模擬消化后各階段的樣品與原始樣品的竹葉碳苷黃酮質量濃度作對比。

口腔、胃、腸道體外消化模型的建立參考文獻[29]。取9 mL樣品溶液，加入1 mLα-淀粉酶，37 ℃孵育10 min后，用1 mol/L的鹽酸溶液調節pH值到2.0，得到模擬口腔消化后的樣品A10（取樣4 個，每個樣品體積500 μL）；在取樣后剩余的A10樣品中加入1 mL胃蛋白酶（10 mg/mL），于37 ℃孵育90 min，然后用碳酸鈉調節pH值至7.0，得到模擬胃消化后的樣品B90（取4 個樣品，每個體積500 μL）；在取樣后剩余的B90樣品中加入2.5 mL胰蛋白酶（10 mg/mL）和2.5 mL膽酸鈉溶液（50 mg/mL），37 ℃孵育90 min，孵育結束后，再經90～95 ℃水浴10 min，得到模擬腸道消化后的樣品C90（取4 個樣品，每個體積500 μL）。黃原膠保護組、直接消化組各階段得到的樣品分別標記為xA10、xB90、xC90和dA10、dB90、dC90，原始樣品記作O。消化后的樣品冷凍干燥后用UPLC法檢測葉炭苷黃酮質量濃度。

1.3.5 4 種竹葉炭苷黃酮質量濃度測定

采用UPLC法測定4 種竹葉炭苷黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素）的質量濃度。未經處理的樣品定容后直接測定。直接消化組和黃原膠保護組樣品經冷凍干燥后，加入1 mL甲醇，漩渦混勻后8 000×g離心10 min，上清液用濾膜過濾后進行UPLC測定。

測試條件：ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），測定波長為340 nm，進樣量為1 μL，流動相A（100%乙腈）、流動相B（體積分數0.1%磷酸溶液）的體積比為80∶20，流速為0.21 mL/min。

1.3.6 生物可及性測定

生物可及性是指物質從基質釋放到消化道中，有可能被吸附進入循環系統（血管）的比例[30]。生物可及性采用下式計算。

1.4 數據統計與分析

數據處理應用SPSS 19.0軟件，采用One-way ANOVA程序進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用主成分分析和聚類分析研究不同處理樣品的4 種碳苷黃酮質量濃度的聚類趨勢，用皮爾遜線性分析法分析4 種碳苷黃酮質量濃度變化之間的線性關系。采用Origin 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 竹葉碳苷黃酮總酚、總黃酮含量及UPLC分析結果

圖 1 竹葉提取物中4 種碳苷黃酮（A）、標準品（B）的UPLC圖譜及分子結構（C）Fig. 1 UPLC of four flavonoid C-glycosides in bamboo leaf extract (A)and standard solutions (B), as well as their structures (C)

提取物中總酚含量為（78.83±1.29）mg/g，總黃酮含量為（79.93±2.08）mg/g。如圖1所示，原始樣品中異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素的質量濃度分別為239.25、67.05、58.12、27.04 mg/L。體外消化后的樣品在不同消化階段取樣后冷凍干燥，取干燥后的樣品進行UPLC分析。

2.2 體外模擬消化中各階段不同樣品組的竹葉黃酮質量濃度

由圖2可知，原始樣品組的4 種碳苷黃酮的質量濃度均最高。而直接消化組樣品結果顯示，口腔、胃、腸道的模擬消化均會造成4 種碳苷黃酮質量濃度不同程度地下降，各個消化階段造成的黃酮質量濃度下降的趨勢存在差異。與原始樣品相比，模擬口腔消化階段，直接消化組、黃原膠保護組樣品異葒草苷質量濃度分別下降約30%、20%；模擬胃消化階段，直接消化組樣品異葒草苷質量濃度下降50%左右，而黃原膠保護組的異葒草苷質量濃度約下降35%；模擬腸道消化階段，直接消化組樣品異葒草苷質量濃度下降88%左右，而黃原膠保護組的異葒草苷質量濃度約下降85%。以上結果表明，直接消化組和黃原膠保護組樣品在3 個消化階段的異葒草苷質量濃度均存在顯著性差異（P＜0.05）。綜合比較3 種體外模擬消化階段發現，腸道模擬消化對異葒草苷造成的損失最大。對于異牡荊素和牡荊素，模擬腸道消化后，黃原膠保護組的質量濃度分別降低了62%和59%，遠低于直接消化組（分別降低84%和80%）。所有樣品中4 種黃酮的質量濃度均為：異葒草苷＞葒草苷＞異牡荊素＞牡荊素。

圖 2 不同模擬消化階段各樣品中4 種碳苷黃酮的質量濃度Fig. 2 Concentrations of four flavonoid C-glycosides at different digestion stages

與直接消化組相比，黃原膠保護組4 種碳苷黃酮質量濃度的下降均顯著減緩（P＜0.05），表明黃原膠的加入有效地降低了4 種碳苷黃酮在體外模擬消化過程中的損失。另外，對黃原膠保護組不同模擬消化階段的碳苷黃酮質量濃度進行比較，發現腸道模擬消化造成的碳苷黃酮的損失明顯高于口腔模擬消化和胃模擬消化。胃模擬消化后4 種碳苷黃酮質量濃度相較于口腔模擬消化后僅輕微下降。本課題組在先前針對果膠的研究中同樣證實，口腔模擬消化中碳苷黃酮質量濃度的損失明顯小于胃腸道模擬消化[22]。腸道模擬消化后竹葉碳苷黃酮的損失明顯高于胃模擬消化，可能的原因是，在消化過程中消化液pH值的變化加劇了碳苷黃酮的分解[31]。在腸道模擬消化階段，黃原膠保護組4 種竹葉碳苷黃酮的質量濃度顯著高于直接消化組（P＜0.05），表明黃原膠對4 種碳苷黃酮存在保護作用。本研究結果與先前關于纖維素可以提升植物活性物質生物可及性的研究結果[23,32]一致。

2.3 體外模擬腸消化后碳苷黃酮質量濃度變化的線性關系

表 1 模擬腸消化后4 種碳苷黃酮質量濃度的皮爾遜分析結果Table 1 Pearson analysis of linear correlations among four flavonoid C-glycosides after intestinal digestion

對模擬腸消化后的4 種碳苷黃酮的質量濃度進行皮爾遜相關性分析，結果如表1所示。相關系數r值大于0.9，表明有良好的線性關系，P＜0.05表明線性關系顯著，P＜0.01表明線性相關性極顯著。由于P＜0.01，因此4 種碳苷黃酮的質量濃度存在極顯著線性相關性。對4 種碳苷黃酮的質量濃度進行線性擬合，如圖3所示，4 個重復的7 種樣品（原始樣品＋3 個階段（口腔、胃、腸道消化）直接消化組樣品＋3 個階段（口腔、胃、腸道消化）黃原膠保護組樣品）線性擬合結果顯示，不同樣品的4 種黃酮質量濃度之間均存在良好的線性關系。

圖 3 不同處理組4 種碳苷黃酮質量濃度之間的線性關系Fig. 3 Linear correlations among concentrations of flavonoid C-glycosides

2.4 不同模擬消化階段4 種碳苷黃酮生物可及性的變化

表 2 不同處理樣品中4 種竹葉碳苷黃酮的生物可及性Table 2 Bioaccessibility of four flavonoid C-glycosides in different samples

為了進一步揭示黃原膠對碳苷黃酮的保護作用，對不同體外模擬消化階段4 種碳苷黃酮的生物可及性進行了比較（表2）。比較直接消化組樣品的異牡荊素和牡荊素的生物可及性，發現經模擬腸道消化后，加入黃原膠后異牡荊素的生物可及性提升了140%，牡荊素的生物可及性提升了105%。比較3 個體外模擬消化階段發現，黃原膠保護組4 種竹葉碳苷黃酮的生物可及性均高于直接消化組樣品，表明黃原膠處理對胃模擬消化和腸道模擬消化時黃酮的降解存在保護作用。綜上，黃原膠的加入提升了體外模擬消化過程中4 種碳苷黃酮的生物可及性。

同時，比較發現，黃原膠對異牡荊素和牡荊素的保護作用明顯強于對異葒草苷和葒草苷的保護作用，可能是其結構不同導致的[33]：異葒草苷和葒草苷是同分異構體，其結構相近，在同樣的體外模擬消化處理環境中降解程度接近；牡荊素和異牡荊素是同分異構體，體外模擬消化對其生物可及性的影響接近。盡管黃原膠保護組牡荊素和異牡荊素在腸道模擬消化后生物可及性高于直接消化組80%以上，但總體的生物可及性仍需提高，以使其更好地發揮竹葉碳苷黃酮的生物功效。

2.5 竹葉碳苷黃酮質量濃度變化的主成分分析與聚類分析結果

圖 4 不同處理組碳苷黃酮聚類分析的三維得分圖Fig. 4 Cluster plot of top three principal components for flavonoid C-glycosides in different groups

為進一步探究黃原膠的加入對4 種竹葉碳苷黃酮質量濃度的影響，對原始樣品、直接消化組樣品、黃原膠保護組樣品中4 種碳苷黃酮的質量濃度進行主成分分析。如圖4所示，前3 個主成分（PC1、PC2、PC3）可以代表99.89%的信息。不同處理組樣品呈現不同的聚類趨勢，原始樣品聚為一組，直接消化組樣品聚為一組，黃原膠保護組樣品聚為一組，表明主成分可以很好地反映樣品信息，各組樣品組內的黃酮質量濃度變化差異小。對樣品進行聚類分析（圖5），結果顯示，樣品xC90與樣品dC90在歐氏距離平方1.2左右聚為一類，樣品xB90、dB90、xA10與dA10在歐氏距離平方1.3聚為一類，與主成分分析結果一致，表明模擬消化階段影響4 種竹葉碳苷黃酮質量濃度的聚類趨勢。聚類趨勢分析表明，模擬口腔及胃消化與模擬腸道消化時，不同處理組樣品的4 種竹葉碳苷黃酮質量濃度存在差異。

圖 5 不同處理組的聚類分析圖Fig. 5 Cluster analysis of different groups of samples

2.6 黃酮生物可及性變化機制的分析結果

研究證實，淀粉及纖維素等可以在胃腸道消化過程中以成膠或者包覆的形式對植物活性小分子物質提供保護[23,34]。纖維素或者淀粉的分子空腔可以容納小分子的生物活性物質，使其抵御消化液消化[35-36]。纖維素分子的物理包覆或者封裝減少了黃酮分子的降解，使其更容易通過消化道壁繼而進入循環系統發揮其生物活性[22]。植物黃酮與其他的食品成分混合可以有效地緩解由消化液pH值變化產生的降解，提升其生物可及性。Chen Hua等[37]也證實了玉米淀粉的支鏈空隙可以容納槲皮素分子，并有望作為小分子活性物質的理想載體。圖6為黃原膠分子對竹葉碳苷黃酮分子的保護作用示意圖，黃原膠分子內的氫鍵以及黃原膠分子的交聯結構形成的空腔可以容納黃酮分子，在消化過程中增加其抵御消化液消化的能力，提升其生物可及性[18-19]。

圖 6 黃原膠提升竹葉提取物中竹葉碳苷黃酮在模擬消化過程中的生物可及性示意圖Fig. 6 Schematic of branch space of xanthan gum for the improvement of bamboo leaf flavonoids bioaccessibility during simulated in vitro gastrointestinal digestion

3 結 論

本研究利用體外模擬消化模型，結合UPLC技術分析竹葉提取物中4 種碳苷黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素和牡荊素）的質量濃度變化，探究黃原膠對竹葉碳苷黃酮在消化過程中的保護作用。結果顯示，相較于直接消化組樣品，黃原膠的加入可以顯著減少在模擬消化過程中竹葉碳苷黃酮的降解，利于提升其生物可及性。口腔、胃、腸道模擬消化對竹葉碳苷黃酮的生物可及性影響存在差異，其中腸道模擬消化對直接消化組和黃原膠保護組樣品的竹葉碳苷黃酮質量濃度影響高于口腔和胃模擬消化處理。黃原膠的加入可以提升牡荊素和異牡荊素的生物可及性。綜上，黃原膠有助于提升體外模擬消化過程中竹葉碳苷黃酮的生物可及性，對于相關功能產品的開發具有較好的應用價值。