巨大芽孢桿菌L2發酵產物對魔芋軟腐病菌的抑菌機制

趙妗頤，肖 洋，楊 龍，張 素，吉玉玉，李 祝,*

（1.貴州大學生命科學學院/農業生物工程研究院，山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室，山地生態與農業生物工程協同創新中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省產品質量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550003）

魔芋（Amorphophallus konjacK. Koch）又名蒟蒻、鬼芋等，隸屬天南星科魔芋屬，為多年生草本植物[1]，為我國西南地區重要經濟作物。魔芋球莖中含有葡甘聚糖、淀粉、粗纖維和各種氨基酸、蛋白質等物質[2-3]，其加工產物魔芋膠、魔芋粉等已被廣泛用作天然、健康、安全的食品原料[4]。但魔芋球莖水分含量高，易破損、腐爛、病變，在保藏期間對濕度、溫度的要求高，容易受到病原菌的侵染[5]，其中胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovorasubsp.carotovora）引起的細菌性病害——魔芋軟腐病是導致貯藏期魔芋腐爛變質的主要原因之一，病菌可從傷口侵入魔芋體內[6-7]。而目前貯藏期魔芋軟腐病主要依靠農用鏈霉素來防治[8]，但隨著人類對食品安全問題的日益重視，化學防治方式被在采后農產品上的應用嚴格限制，因此尋求更加安全的采后農產品病害防治方法對控制魔芋貯藏期軟腐病具有十分重要的意義。

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）作為食品工業技術中非常重要的微生物，在控制水稻紋枯病、番茄灰霉病、花生貯藏期中的黃曲霉等病害防治中得到廣泛應用[9-11]，并且其產生的谷氨酸脫羧酶可催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸[12]，該氨基酸作為哺乳動物神經系統中重要的神經傳遞素，具有降低血壓、鎮靜、利尿等功能[13-14]。

本研究通過常壓硅膠柱層析得到巨大芽孢桿菌發酵產物各流分，經檢測，流分LE4-3對貯藏期魔芋軟腐病原菌——胡蘿卜軟腐歐文氏菌EC-1（以下簡稱EC-1）有良好抑制作用，并經氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析其成分，再對其抑菌機理進行研究，著重考察該活性流分對EC-1細胞膜通透性、大分子物質核酸和蛋白含量變化、可溶性總糖質量濃度、菌體總蛋白、菌體磷代謝和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平變化的影響，旨在為貯藏期魔芋軟腐病的控制提供一定的應用理論參考和依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）L2（CCTCC No. M2012381）由貴州大學真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養物保藏中心。EC-1由貴州大學微生物所分離、鑒定并保存。

牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL；發酵液體培養基：蛋白胨25 g、牛肉膏4.58 g、氯化鈉3.21 g、葡萄糖15 g、蒸餾水1 000 mL。

ROS檢測試劑盒 上海碧云天公司。

1.2 儀器與設備

DDB303A電導率儀 上海雷磁儀器廠；CAMX PLUS酶標儀 美國Molecular Devices公司；BIOMATE 3S紫外分光光度計 美國Thermo Fisher公司；JY300HE電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；7890A/5975C型GC-MS儀 美國Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 巨大芽孢桿菌發酵產物的提取及分析

1.3.1.1 巨大芽孢桿菌菌粉的制備

巨大芽孢桿菌L2種子液的制備：接種一環巨大芽孢桿菌L2于裝有100 mL牛肉膏蛋白胨培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、150 r/min培養24 h，使其OD600nm為0.6～0.8。

將上述巨大芽孢桿菌L2種子液按體積分數6%的接種量接種于裝有80 L發酵液體培養基的發酵罐中，在30 ℃、150 r/min、通氣量為1.5 L/min的條件下培養48 h，發酵液經噴霧干燥制成菌粉備用。

1.3.1.2 巨大芽孢桿菌發酵產物的提取及常壓硅膠柱層析分離

取500 g菌粉加入1.5 L工業乙醇于60～100 ℃回流提取4 h，重復3 次得巨大芽孢桿菌粗提液，將該粗提液減壓濃縮后加水溶解，再通過乙酸乙酯萃取，萃取液經減壓濃縮后得到的浸膏（19.23 g）與40～80 目硅膠拌樣，揮干溶劑上樣，在硅膠層析柱上進行常壓硅膠柱層析。分別用石油醚-乙酸乙酯（100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1，V/V）、乙酸乙酯-甲醇（30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶0，V/V）進行梯度洗脫，每個梯度柱層析體系為10 L，分段收集洗脫液。通過薄層層析色譜（thin layer chromatography，TLC）結果及Rf值判斷，體積分數5%的濃硫酸-乙醇溶液和0.8 g/100 mL磷鉬酸-乙醇溶液顯色綜合分析，將相同主點流分合并得17 個段：LE1～LE17。TLC展開體系選取石油醚-乙酸乙酯（50∶1，V/V），展開3 次，主點Rf值為0.3的流分LE4（2.721 7 g）繼續進行常壓硅膠柱層析。分別用石油醚-乙酸乙酯（80∶1、60∶1、40∶1、20∶1，V/V）、甲醇進行洗脫，并通過TLC及顯色分析將LE4流分沖柱合并得7 個段：LE4-1～LE4-7，分段收集洗脫液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.1.3 LE4-1～LE4-7對EC-1抑菌作用的測定

LE4-1～LE4-7用二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）配制成200 mg/mL的母液備用。分別在牛肉膏蛋白胨液體培養基中以體積分數10%的接種量接入EC-1種子液（OD600nm為0.6～0.8），再分別加入LE4-1～LE4-7母液，使其終質量濃度均為2.0 mg/mL，并以無菌水為空白對照、氯霉素為藥物對照、DMSO為溶劑對照，30 ℃、150 r/min恒溫搖床培養24 h后于490 nm波長處測定吸光度，并按下式計算抑菌率。

1.3.1.4 LE4-3的GC-MS分析

脂肪酸甲酯化：稱取50 mg LE4-3，加入2 mL體積分數1%的硫酸-甲醇溶液，超聲振蕩10 min后置于70 ℃水浴30 min取出，加入2 mL正己烷，振蕩5 min后取上清液加入0.5～1.0 g無水硫酸鈉及5 mL飽和NaCl溶液，振蕩1 min，靜置5 min，取上層溶液用0.22 μm有機濾膜過濾，備用。

GC-MS條件：取LE4-3直接進樣1 μL，色譜柱為AB-INOWAX毛細管柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm）；初始溫度50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃后，保持15 min，運行時間55 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（純度99.999%）；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時間5.0 min。離子源為電子轟擊離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發射電流34.6 μA，倍增器電壓1 624 V，接口溫度280 ℃，質量范圍29～500 amu。

1.3.2 LE4-3的抑菌機制分析

1.3.2.1 LE4-3 IC50的測定

按1.3.1.3節方法測定LE4-3與氯霉素的半數抑制質量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。LE4-3終質量濃度設置為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL，氯霉素為0.06、0.08、0.1、0.2、0.4 mg/mL，并用SPSS Statistics 19.0軟件分別計算兩者的IC50。

1.3.2.2 菌液電導率的測定

根據宋麗雅等[15]的方法，將菌懸液（OD600nm為0.6～0.8）按體積分數10%的接種量接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，并加入LE4-3母液使其終質量濃度為IC50，于30 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養。在培養0、10、20、30、40、50、60 min時，各取5 mL培養液經5 000 r/min離心5 min后取上清液測其電導率。以無菌水為空白對照，氯霉素為藥物對照，每組設3 個平行，下同。

1.3.2.3 核酸蛋白質泄漏的測定

根據劉國榮等[16]的方法，并按1.3.2.2節方法處理樣品，在培養0、2、4、6、8、10、12 h時，各取3 mL培養液，經4 500 r/min離心5 min后取上清液分別在260 nm和280 nm波長處測定光密度值。

1.3.2.4 可溶性總糖質量濃度的測定

葡萄糖質量濃度標準曲線的繪制參考文獻[17]：精確量取1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于不同試管中，分別加入蒸餾水至總體積為1.0 mL，搖勻后取50 μL加入200 μL蒽酮試劑，冰浴5 min，沸水浴10 min，冷卻至室溫，用酶標儀于630 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度為橫坐標（mg/mL），吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到葡萄糖質量濃度標準曲線方程y＝3.906 0x＋0.056 9，決定系數R2＝0.999 1，具有良好線性關系，滿足樣品測試要求。

可溶性總糖質量濃度的測定采用蒽酮比色法。根據錢麗紅等[18]的方法，并按1.3.2.2節方法處理樣本，分別在培養0、2、4、6、8、10、12 h時，各取1 mL菌液10 000 r/min離心5 min后取50 μL上清液，按上述方法操作，用酶標儀于630 nm波長處測定吸光度。將所測吸光度代入葡萄糖標準曲線方程，計算可溶性總糖質量濃度。

1.3.2.5 SDS-PAGE分析

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參照吳海霞[19]的方法并作改動：按1.3.2.2節方法處理樣品，分別在培養0、4、8、12 h時取菌懸液1 mL，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，無菌水洗滌沉淀2 次，加入40 μL 2×上樣緩沖液，沸水浴10 min，離心取上清液。采用質量分數12%分離膠、質量分數5%濃縮膠，電極緩沖液為5×Tris-甘氨酸，上樣量10 μL，電壓85 V，電流100 mA，時間1.5～2.0 h，質量分數0.5%考馬斯亮藍R-250染液過夜染色，脫色液為乙醇-醋酸-水溶液（10∶5∶85，V/V），脫色完成后使用凝膠成像儀拍照并分析。

1.3.2.6 LE4-3對EC-1菌體磷代謝的影響

磷標準曲線的繪制：精確量取500 μg/mL磷標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于不同試管，分別加入蒸餾水至總體積為1.0 mL，搖勻取0.1 mL加入1 mL三氯乙酸-硫酸亞鐵溶液反應10 min，4 000 r/min離心5 min，取0.2 mL上清液加50 μL鉬酸銨溶液，混勻，30 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，用酶標儀于630 nm波長處測定吸光度。以標準磷質量濃度為橫坐標（μg/mL），以吸光度為縱坐標，得到磷質量濃度標準曲線方程為y＝0.003 7x＋0.069 3，決定系數R2＝0.995 6，具有良好線性關系，滿足樣品測試要求。

菌體磷質量濃度的測定參考翟培等[20]的方法并作改動。將EC-1菌懸液4 000 r/min離心5 min棄上清液，無菌水洗滌菌體2 次，并稀釋菌體至OD600nm為0.5。取0.5 mL稀釋菌液于試管中，按體積比1∶1加入1.0 mg/mL葡萄糖溶液，搖勻加入200 μL 500 μg/mL磷標準溶液，并加入LE4-3母液使其終質量濃度為IC50，依次培養至0、2、4、6、8、10、12 h時，取0.1 mL菌懸液按上述方法進行測定，并用酶標儀于630 nm波長處測定吸光度。將所測吸光度代入磷質量濃度標準曲線方程，計算磷質量濃度。

1.3.2.7 ROS水平的測定

嚴格按照ROS檢測試劑盒說明書檢測LE4-3處理菌體內ROS水平，以無菌水為空白對照，Rosup為陽性對照，每組設3 個平行。以2’,7’-二氯熒光素的熒光強度表示菌體細胞內ROS水平，熒光強度越強表明ROS水平越高。采用Image J軟件進行熒光強度定量分析。

1.4 數據處理與分析

實驗數據用Microsoft Excel 2010軟件進行數據分析，用Image J 17.0軟件對熒光定量數據進行采集，采用SPSS Statistics 19.0軟件進行統計分析，采用Duncan’s法對各測定數據進行顯著性檢驗，所有實驗設3 個平行，結果以表示。

2 結果與分析

2.1 LE4-1～LE4-7對EC-1的抑制作用

圖 1 流分LE4-1～LE4-7對EC-1的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of the fraction LE4-1-LE4-7 on action on EC-1

由圖1可知，流分LE4-3、LE4-4、LE4-5對EC-1的抑菌效果較好，其中LE4-3的抑菌率最高，為（79.40±0.47）%，且與LE4-4、LE4-5差異顯著（P＜0.05）。藥物對照氯霉素的抑菌率為（89.20±0.99）%，溶劑對照DMSO抑菌率為（5.92±0.12）%，即該溶劑對EC-1影響較小，可作為配制LE4-1～LE4-7母液的溶劑。

2.2 LE4-3的GC-MS分析結果

LE4-3的總離子流圖及GC-MS檢測結果見圖2及表1。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對NIST2005和Wiley275標準質譜圖，確定了LE4-3的化學成分，用峰面積歸一化法計算各化學成分的相對含量。由表1可知，LE4-3共檢測到34 種化合物，鑒定出其中21 種成分，主要物質為苯乙酸乙酯（相對含量32.190%）、亞油酸（相對含量15.819%）、苯乙酸甲酯（相對含量13.793%）、硬脂酸乙酯（相對含量9.105%）。

圖 2 流分LE4-3的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of fraction LE4-3

表 1 流分LE4-3的化學成分Table 1 Chemical composition of fraction LE4-3

近年來研究者對脂肪酸及其衍生物如脂肪酸甲酯、脂肪酸甘油酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪醇、磺化脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯等的抑菌作用十分關注，該類物質已被美國食品及藥品管理局認證為一般公認安全的食品添加劑[21-22]。Kelsey[23]與Sun[24]等報道了脂肪酸及其衍生物對金黃色葡萄球菌和幽門螺旋桿菌有良好的抑制作用；王君等[25]從黃粉蟲成蟲體內提取的脂類抗菌物質對蘋果炭疽病害和梨黑星病害有明顯的抑制作用。此外，據俞發榮等[26]報道，十八烯酸對人腎癌細胞A498細胞具有毒性作用；Yamazakti等[27]報道棕櫚酸的甘油單酯對李斯特菌有一定的抑制作用。因此具有抑菌作用的脂肪酸及其衍生物可以作為安全高效的天然防腐劑應用于食品。

2.3 LE4-3的抑菌機制分析結果

2.3.1 LE4-3的IC50測定結果

圖 3 LE4-3對EC-1的IC50Fig. 3 IC50 of chloramphenicol and fraction LE4-3 against EC-1

由圖3可知，LE4-3質量濃度為1.2 mg/mL時抑菌率可達（78.60±0.94）%，與1.4 mg/mL時的抑菌率差異不顯著（P＞0.05）；而氯霉素在質量濃度為0.4 mg/mL時抑菌率已達（81.60±0.45）%。LE4-3與氯霉素的IC50分別為（1.06±0.01）、（0.08±0.00）mg/mL，選擇IC50進行后續實驗。

2.3.2 LE4-3對菌液電導率影響

細胞膜作為細菌的保護屏障，當細菌受到藥物毒害或處于不利環境時細胞膜完整性被破壞，使胞內物質外泄至培養液中，進而使培養液的電導率上升[28-29]。由圖4可知，LE4-3作用EC-1菌體初期，上清液電導率與作用時間呈正相關，且氯霉素與LE4-3組始終高于空白組，當作用60 min時，LE4-3組的電導率相比空白組與氯霉素組分別增加了8.98%、4.90%（P＜0.05），推測LE4-3能改變EC-1菌體細胞膜通透性，使菌體細胞內物質的外泄到培養液中。

圖 4 流分LE4-3對EC-1培養液電導率的影響Fig. 4 Effect of fraction LE4-3 on extracellular conductivity of EC-1

2.3.3 LE4-3對菌體核酸、蛋白質泄漏的影響

圖 5 LE4-3對EC-1核酸、蛋白質泄漏的影響Fig. 5 Effect of fraction LE4-3 on nucleic acid and protein leakage of EC-1

培養液OD260nm和OD280nm可反映菌體細胞DNA與RNA的泄漏情況，從而推測菌體細胞膜結構的完整性[30]。由圖5可知：隨著培養時間的延長，氯霉素組的核酸和蛋白含量基本與空白組持平，但LE4-3作用菌體后培養液中核酸、蛋白質的含量均高于空白組與氯霉素組；在培養12 h時，LE4-3組OD260nm和OD280nm分別為0.046 7±0.001 1和0.081 3±0.001 5，明顯高于空白組（32.1%、23.9%）和氯霉素組（62.6%、23.9%），因此推測LE4-3破壞了EC-1細胞膜完整性，導致細胞內核酸、蛋白外泄。

2.3.4 LE4-3對菌液可溶性總糖質量濃度的影響

糖類是微生物重要的能源和碳源。在正常條件下微生物能主動從環境中攝取所需營養物質，而當膜結構遭到破壞時，細胞內物質包括糖類發生泄漏，所以可通過測定細菌培養液中可溶性總糖質量濃度變化檢測細菌膜結構完整性[31]。由圖6可知，LE4-3處理EC-1后胞外溶液可溶性總糖質量濃度與培養時間呈正相關，培養12 h時達到（0.502±0.039）mg/mL，為空白組的340%，說明LE4-3在增加EC-1細胞膜通透性同時也破壞了其細胞膜完整性，導致大分子糖類物質泄漏到胞外，而空白組中可溶性總糖質量濃度與培養時間呈負相關，說明菌體細胞膜保持完整，并能吸收菌體外糖類物質供自身利用。

圖 6 LE4-3對EC-1菌液可溶性總糖質量濃度的影響Fig. 6 Effect of fraction LE4-3 on soluble total sugar concentration of EC-1

2.3.5 LE4-3對菌體蛋白表達的影響

圖 7 LE4-3處理后EC-1菌體總蛋白的SDS-PAGE圖譜 Fig. 7 SDS-PAGE of total bacterial proteins from EC-1 treated with fraction LE4-3

SDS-PAGE可測定未知蛋白分子質量大小[32]，也可通過SDS-PAGE圖譜反映蛋白質含量的變化[33]。由圖7可知，當氯霉素處理4、8、12 h時，菌體總蛋白含量明顯低于空白組。氯霉素能與核糖體50S亞基相結合，進而特異性的阻止mRNA與核糖體結合，從而抑制蛋白質的合成[34-35]。而LE4-3處理4、8、12 h時，菌體總蛋白含量同樣低于空白組，則說明LE4-3處理也可阻礙EC-1菌體蛋白合成，起到抑制作用。

2.3.6 LE4-3對菌體磷代謝的影響

磷是所有生物必需的微量元素，是核酸、磷脂及糖代謝中間產物的重要組成成分，在細胞能量代謝中起核心作用，細菌可利用葡萄糖經一系列磷酸化反應，為生長繁殖提供所需能量，因此通過檢測細菌代謝活動中磷消耗狀況可反映出細胞整體代謝功能和生長狀態[36]。

由圖8可知，空白組磷質量濃度與培養時間呈負相關，說明菌體在生長過程中消耗培養體系中的磷進行正常的代謝活動，而經LE4-3和氯霉素處理后菌體磷代謝受到嚴重影響，在培養2 h后磷代謝緩慢，且磷質量濃度與培養時間呈負相關但與空白組差異明顯，表明LE4-3與氯霉素可影響EC-1細胞磷代謝，因此推測EC-1菌體細胞經LE4-3處理后磷代謝能力減弱，進而導致細胞能量代謝受阻。

圖 8 LE4-3對EC-1磷代謝含量的影響Fig. 8 Changes in phosphorous metabolism in EC-1 treated with fraction LE4-3

2.3.7 LE4-3對ROS水平的影響

圖 9 LE4-3對EC-1內ROS水平的熒光定量分析Fig. 9 Fluorescent quantitative analysis of ROS level in EC-1 treated with fraction LE4-3

ROS具有很強的氧化活性，是一類分子氧部分還原的分子或離子，過量的ROS能夠使DNA、蛋白質、脂類等生物大分子發生過氧化鏈式反應，造成細胞結構的損傷，影響生理活性，胞內ROS過度積累，會對膜脂、蛋白質、核酸等產生氧化損傷，進而觸發或者加速細胞凋亡進程[37-39]。由圖9可知，LE4-3可以刺激EC-1菌體產生較多ROS，LE4-3胞質中ROS水平呈先升后降趨勢，在培養30 min時出現峰值，為空白組的338%，與其相比差異極顯著（P＜0.01），推斷LE4-3可造成EC-1細胞氧化損傷。

3 結 論

巨大芽孢桿菌L2流分LE4-3對魔芋軟腐病原菌EC-1具有良好抑制作用，其IC50為（1.06±0.01）mg/mL，經GC-MS共檢測到34 種成分，鑒定出其中21 種已知化合物，其中苯乙酸乙酯、亞油酸乙酯、苯乙酸甲酯為相對含量最高的3 種物質；并且推測LE4-3可通過影響細胞膜功能、損傷細胞結構、抑制細胞蛋白質合成及能量代謝等方面抑制EC-1生長，為開發魔芋貯藏期軟腐病天然防腐劑防治提供了理論依據。