血清膽汁酸譜系測定在肝硬化診斷中的應用價值

易佳音，張淑鳳，馮慧芬，孫會卿，王 斌，趙 敬

鄭州大學第五附屬醫院消化內科 鄭州 450052

我國肝硬化發病率高，影響面廣，而明確肝損傷程度、分辨肝硬化早期改變和判斷肝硬化分級一直是備受臨床醫生關注的課題，臨床多用Child-Pugh分級來判斷肝損傷的嚴重程度和明確分級[1-2]，但此評分系統會受到主觀因素的影響。血清膽汁酸是反映肝臟合成、分泌及轉運功能的一項指標，在肝硬化發展過程中呈現動態的改變，是作為判斷肝損傷程度和明確肝硬化狀態及分級的一項良好的指標[3-5]。本研究對肝硬化組及正常對照組血清膽汁酸譜系進行了檢測，以明確血清膽汁酸譜系評估肝損傷程度、提示早期肝硬化及確定肝硬化分級的價值，并期望找到肝硬化治療的突破點。

1 對象與方法

1.1研究對象篩選2018年4～9月鄭州大學第五附屬醫院收治的肝硬化(排除膽汁淤積型肝硬化)患者34例，其中男19例，女15例，年齡45～82(58.0±9.3)歲，肝硬化的診斷基于臨床表現、實驗室檢查、CT或MRI典型成像表現的組合；正常對照組來自同期在本院進行健康體檢的志愿者50例，年齡33～80(56.8±11.7)歲，其中男27例，女23例，兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。該實驗方案獲本院倫理委員會批準，所有入選對象對該研究知情同意。

1.2檢測項目及方法正常對照組于本院空腹查總膽汁酸、膽紅素、白蛋白、凝血酶原時間等檢查并記錄結果。肝硬化組入院第2天空腹行基礎生化檢查，進行Child-Pugh分級(Child A級5～6分，Child B 級7～9分，Child C級10～15分)并記錄；同時采集兩組研究對象的靜脈血；離心、收集血清1 mL，使用液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)檢測血清中5種未結合膽汁酸[膽酸(CA)、脫氧膽酸(DCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、熊脫氧膽酸(UDCA)、石膽酸(LCA)]、10種結合膽汁酸[甘氨膽酸(GCA)、甘氨石膽酸(GLCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺石膽酸(TLCA)、牛磺脫氧膽酸(TDCA)、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)]。

1.3統計學處理采用SPSS 22.0進行數據分析，經檢測兩組膽汁酸譜系各組分數據為非正態分布，采用中位數和上、下四分位數表示[中位數(P25，P75)]，正常對照組和肝硬化組、正常對照組和Child-Pugh A級組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；Child-Pugh A、B、C級三組組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗；對膽汁酸譜系進行診斷特征曲線(ROC)分析，選取具有較高診斷價值的指標，計算其靈敏度及特異度。計算總膽汁酸、膽紅素、白蛋白、凝血酶原陽性率，與有較高診斷價值指標的陽性率做比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1肝硬化患者膽汁酸譜系測定結果見表1。由表1可知，與正常對照組相比，肝硬化組血清未結合膽汁酸含量減少，結合膽汁酸含量明顯增多。

表1正常對照組和肝硬化組膽汁酸譜系含量比較[M(P25，P75)] nmol/L

膽汁酸譜系正常對照組(n=50)肝硬化組(n=34)ZPCA95.39(55.70,193.17)87.31(56.99,563.64)0.5830.560 DCA333.35(102.68,574.32)117.73(50.69,312.42)2.5480.011CDCA719.85(346.20,1 447.04)254.53(116.09,743.08)3.518<0.001UDCA139.89(71.13,265.03)66.55(22.77,348.69)2.2870.022LCA36.67(17.89,49.57)17.72(6.65,26.67)3.746<0.001GCA157.66(65.92,297.69)4 174.69(628.42,9 255.66)6.379<0.001GLCA3.99(1.89,11.27)7.08(2.80,22.97)2.0820.037GDCA168.19(57.76,327.66)237.70(150.50,1 417.63)3.662<0.001GCDCA960.41(448.67,1 601.49)10 034.31(2 008.84,19 065.28)5.522<0.001GUDCA122.60(66.27,346.48)290.20(86.13,1 466.39)2.3150.021 TCA10.70(5.63,29.76)3003.21(134.29,5 583.43)7.062<0.001TLCA0.48(0.09,1.64)3.55(1.36,14.35)4.784<0.001TDCA26.30(7.83,55.44)68.51(8.24,320.41)2.1050.035TCDCA69.61(36.62,137.35)5 847.05(283.17,15 128.50)6.452<0.001TUDCA4.24(1.71,9.60)72.76(9.27,206.36)5.404<0.001

2.2正常對照組與Child-Pugh A級膽汁酸譜系比較見表2。由表2可知，兩組檢測值中CA、DCA、UDCA、GLCA、TDCA差異無統計學意義(P>0.05)，CDCA、LCA、GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA差異有統計學意義(P<0.05)，其中GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA 8種結合膽汁酸在Child-Pugh A級的含量比正常對照組的含量增高。

表2正常對照組與Child-Pugh分級A膽汁酸譜系比較[M(P25，P75)] nmol/L

膽汁酸譜系正常對照組(n=50)Child-Pugh分級A(n=13) ZPCA 95.39(55.70,193.17)85.88(66.91,585.08)0.9320.351DCA333.35(102.68,574.32)212.00(65.44,312.42)2.3280.200CDCA719.85(346.20,1 447.04)334.01(148.90,749.55)2.8350.005UDCA139.89(71.13,265.03)136.00(42.25,454.00)1.1690.243LCA36.67(17.89,49.57)17.80(4.73,27.00)3.465<0.001GCA157.66(65.92,297.69)787.86(333.52,1573.98)5.846<0.001GLCA3.99(1.89,11.27)6.28(2.54,24.07)0.9140.361GDCA168.19(57.76,327.66)218.80(137.00,390.77)2.1220.034GCDCA960.41(448.67,1 601.49)3 530.40(989.25,6 202.60)5.014<0.001GUDCA122.60(66.27,346.48)145.36(70.22,424.23)2.4690.014TCA10.70(5.63,29.76)270.39(70.04,837,18)6.148<0.001TLCA0.48(0.09,1.64)3.00(1.22,8.34)3.974<0.001TDCA26.30(7.83,55.44)65.07(7.00,151.30)1.5860.113TCDCA69.61(36.62,137.35)623.86(162.08,1 328.15)5.846<0.001TUDCA4.24(1.71,9.60)24.54(6.03,48.69)5.103<0.001

2.3不同Child-Pugh分級間膽汁酸譜系的變化見表3。由表3可知，不同Child-Pugh分級間CA、DCA、CDCA、LCA、UDCA、GLCA、TDCA差異無統計學意義(P>0.05)，GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA差異有統計學意義(P<0.05)，并呈現逐級遞增的趨勢。

表3 不同Child-Pugh分級膽汁酸譜系的變化[M(P25，P75)]nmol/L

2.4各型膽汁酸譜系診斷評價結果見表4。由表4可知，有較高診斷價值(AUC>0.90)的指標分別為TCA(AUC=0.956),TCDCA (AUC=0.916), GCA(AUC=0.912)，其敏感度及特異度均較高。

表4 膽汁酸相關診斷性能指標

2.5各指標診斷陽性率比較根據ROC曲線,求取各指標的臨界值，計算相關膽汁酸陽性率，并計算總膽汁酸、白蛋白、膽紅素、凝血酶原的陽性率進行比較分析，見表5。結果表明TCA、TCDCA、GCA三項的陽性率均高于總膽汁酸、白蛋白、膽紅素及凝血酶原。

表5 各項指標陽性率對照表

3 討論

膽汁酸是一種存在于膽汁中、在肝微粒體內由膽固醇合成來的物質，當肝臟發生病變，膽汁酸的合成、分泌和轉運都會受到影響，而膽汁酸譜系的變化比血清總膽汁酸更清楚地反映肝臟這三項功能[3]。膽汁酸譜系在肝硬化早期就有明顯的改變，其發生改變的時間比其他生化指標都早[6-7]，有學者[8]還認為在肝硬化早期，肝臟生化指標均正常時，膽汁酸譜系也會異常，這是一項能反映肝臟輕微異常的指標。且在肝損傷、肝硬化早期、肝硬化代償期及失代償期，膽汁酸譜系比例改變均不相同[9-10]。在對膽汁酸譜系研究中Liu等[11]認為TCA是肝硬化進展的主要生物標志，其細胞實驗發現TCA會增加肝星形細胞的增殖，上調腫瘤壞死因子(TGF)和Ⅰ型膠原的表達。Verbeke等[12]提出體內與肝硬化相關的核受體有法尼醇受體(FXR)以及孕烷X受體(PXR)，膽汁酸作為這些核受體的信號分子調控著肝硬化的發生。其中與FXR、PXR有最大親和力的配體分別為CDCA、LCA[13-14]。兩者間的這種調控作用，也為肝硬化的治療提供了新思路。相關動物實驗[15]表明，小鼠體內膽汁酸轉運蛋白(BSEP)、磷脂酰堿轉運蛋白(MDR3)和多耐藥相關蛋白(MRP2)可以通過調節膽汁酸譜系水平來維持核受體的激活狀態，以阻止肝硬化的進展。相關研究[16-20]表明，乙型肝炎病毒(HBV)和丁型肝炎病毒(HDV)的真正受體是肝臟特異性膽汁酸轉運蛋白-牛磺膽酸鈉協同轉運多肽(NTCP)，該受體通過FXR介導以依賴膽汁酸的方式調控著HBV的轉錄，而且NTCP介導的抗HBV物質與其他途徑相比，耐受性更好。

在本研究中作者使用LC-MS法，高效、高靈敏的檢測了兩組血清膽汁酸譜系，與正常組相比，肝硬化組血清未結合膽汁酸相對含量減少，結合膽汁酸相對含量明顯增多，兩組血清膽汁酸譜檢測值與相關[11]報道基本相同，也印證了該方法和結果的有效性；與正常組相比，Child-Pugh A級患者血清膽汁酸譜系已發生改變，并且隨著肝臟分級的增加肝硬化組膽汁酸譜系中GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA、TCA、TLCA、TCDCA、TUDCA呈現遞增的趨勢，而未結合膽汁酸則出現不同程度的降低，這提示膽汁酸譜系可以反映肝損傷程度、提示早期肝硬化，并可作為Child-Pugh分級的有效補充，減少因腹水和肝性腦病的判斷偏差帶來的人為誤差，以提高肝硬化分級的準確度；同時，肝硬化診斷曲線及陽性率也提示TCA對肝硬化的診斷有高敏感性；而肝硬化組中相對含量減少的未結合膽汁酸就包括CDCA和LCA，這也支持了Verbeke的核受體理論，可為肝硬化治療指明新方向。

綜上所述，肝硬化膽汁酸譜系的檢測不但能早期反映肝損傷及提示早期肝硬化，并可作為Child-Pugh分級的有效補充，準確了解肝硬化病情進展情況，但核受體和轉運蛋白的應用還需更深入的研究，以找到更有效可行的治療方法，最終應用于臨床。