梓醇對哮喘小鼠氣道炎癥及AMPK/ROS/NF-κB信號通路的影響

劉嘉研，李俊峰，車 楠，李 莉，姜京植，李良昌

1)延邊大學醫(yī)學院 吉林延吉 133002 2)吉林省科技廳過敏性疾病重點實驗室 吉林延吉 133002

哮喘是一種常見的氣道炎癥性疾病，主要病理特征為氣道高反應性、氣道平滑肌收縮、氣道重塑以及黏液分泌過多，最后導致氣流受限和呼吸困難。氧化應激是在體內(nèi)外有害因素刺激下，體內(nèi)自由基產(chǎn)生增加或機體抗氧化能力減弱，造成的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[1]。氧化應激介導的信號轉(zhuǎn)導能夠誘導氣道炎癥，導致氣道纖維化、平滑肌細胞增殖以及肺部黏液量增加，進一步加重哮喘[2]。因此，調(diào)控氧化應激已成為哮喘治療的研究熱點。梓醇是一種從中藥地黃中提取的環(huán)烯醚萜苷化合物，具有顯著的藥理作用，能夠抑制LPS和IFN-γ誘導的炎癥反應，減輕D-半乳糖誘導的衰老小鼠腦內(nèi)氧化損傷[3]。也有研究[4]證明梓醇通過減輕嗜酸性粒細胞浸潤，抑制哮喘炎癥。本研究中作者利用卵清蛋白誘導建立哮喘小鼠模型，從氧化應激角度探討梓醇對哮喘氣道炎癥的調(diào)控作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器卵清蛋白、ROS檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒購自美國Sigma公司，白介素(interleukin, IL)-4、IL-5和IL-13 ELISA檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)和磷酸化AMPK(p-AMPK)抗體購自美國Cell Signaling公司，NF-κB(p65)、β-actin和PARP(內(nèi)參)抗體購自美國Santa Cruz公司，梓醇購自中國道斯夫生物公司。402型霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠)，分光光度計、酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Biotek公司)，氣壓體積描記室(韓國All Medicus公司)。

1.2哮喘模型建立與分組雌性BALB/c小鼠40只，體重(18±5) g，由延邊大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組，每組10只。模型組和梓醇低、高劑量組小鼠分別于第1、7、14天腹腔注射200 μL的致敏溶液(含20 μg卵清蛋白+1 mg氫氧化鋁)致敏，正常組以等量生理鹽水代替。第21天將致敏小鼠置于玻璃罩內(nèi)，每組以0.1 g卵清蛋白+10 mL生理鹽水霧化激發(fā)30 min，1次/d，共7 d。梓醇低、高劑量組分別在激發(fā)前1 h灌服梓醇50或100 mg/(kg·d)，共7 d。

1.3氣道高反應性檢測最后一次卵清蛋白激發(fā)4 h后，將清醒的大鼠置于體描室，記錄3 min內(nèi)平均基線讀數(shù)，依次吸入2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 g/L乙酰膽堿20 s，記錄3 min內(nèi)平均讀數(shù)。計算增強呼氣間歇(%)，用以反映氣道高反應性。

1.4實驗樣本獲取及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細胞檢測末次激發(fā)48 h后處死小鼠，收集BALF，4 ℃，3 000 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃保存，待測細胞因子。離心沉淀涂片后Diff-quik染色，鏡下進行細胞分類。取右肺下葉，用體積分數(shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，進行HE染色。余肺葉放入液氮中速凍，-80 ℃保存待用。

1.5BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量測定按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測BALF中IL-4、IL-5、IL-13含量。

1.6肺組織中ROS、SOD和MDA的檢測取500 mg肺組織樣品制備勻漿，根據(jù)試劑盒說明書步驟分別用流式細胞術和比色法測定ROS(以平均熒光強度表示)、SOD以及MDA。

1.7肺組織中p-AMPK、AMPK和NF-κB(p65)蛋白表達的檢測取肺組織，裂解獲取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每個泳道加樣20 μg總蛋白，在120 g/L SDS-PAGE膠上進行蛋白分離(120 V、90 min)，分離蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h后，分別加入AMPK、p-AMPK和NF-κB(p65)一抗(分別按1∶500、1∶500和1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。洗膜后再加HRP標記的二抗，37 ℃孵育1 h。洗膜，加ECL顯色，用Gel Doc進行圖像采集。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 14.0處理數(shù)據(jù)，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較各組小鼠BALF中炎癥細胞數(shù)目和炎癥細胞因子水平，小鼠肺組織中ROS、SOD、MDA含量及AMPK、p-AMPK、NF-κB(p65)蛋白表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1梓醇對哮喘小鼠氣道高反應性的影響4組小鼠氣道高反應性檢測結(jié)果見表1。模型組和梓醇低、高劑量組小鼠氣道反應性均高于正常對照組；而梓醇低、高劑量組較模型組降低。

表1 4組小鼠氣道高反應性比較 %

*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

2.2梓醇對哮喘小鼠肺組織病理學改變的影響HE染色結(jié)果(圖1)顯示，與正常對照組相比，模型組和梓醇低、高劑量組小鼠肺部明顯存在炎癥細胞浸潤、平滑肌增厚和氣道黏膜水腫等哮喘病理特征；而與模型組比較，梓醇低、高劑量組上皮細胞增生受抑，炎癥細胞浸潤減少，黏膜水腫改善。

A、B、C、D：分別為正常對照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組

2.3梓醇對哮喘小鼠BALF中炎癥細胞數(shù)的影響與正常對照組相比，模型組和梓醇低、高劑量組BALF中淋巴細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)均升高；與模型組比較，梓醇組小鼠炎癥細胞數(shù)降低，且梓醇高劑量組更低，見表2。

2.4梓醇對哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的影響結(jié)果見表3。模型組和梓醇低、高劑量組BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平高于正常對照組;而梓醇低、高劑量組均較模型組降低，其中高劑量組IL-5和IL-13水平更低。

表2 4組小鼠BALF中炎癥細胞數(shù)的比較 ×104個/mL

*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

表3 4組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的比較 ng/L

*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

2.5梓醇對哮喘小鼠肺部氧化應激的影響結(jié)果見表4。與正常對照組相比，模型組和梓醇低、高劑量組小鼠肺組織勻漿中ROS和MDA含量升高，SOD活力下降，提示哮喘小鼠肺部存在氧化應激損傷；而與模型組比較，梓醇低、高劑量組小鼠肺組織中ROS和MDA含量下降，SOD活力增強，說明梓醇尤其是高劑量梓醇能夠減輕哮喘小鼠肺部氧化應激反應。

表4 4組小鼠肺組織中ROS、MDA含量和SOD活性的比較

*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

2.6梓醇對哮喘小鼠肺組織中NF-κB(p65)、p-AMPK表達的影響結(jié)果見圖2、3，表5。模型組和梓醇低、高劑量組小鼠肺組織中NF-κB(p65)表達水平高于正常對照組，p-AMPK表達水平低于正常對照組；而與模型組比較，梓醇低、高劑量組小鼠肺組織中NF-κB(p65)的表達均降低，p-AMPK的表達均升高，且高劑量組變化更顯著。

1～4：分別為正常對照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組

圖2 4組小鼠肺組織中NF-κB(p65)的表達

1～4：分別為正常對照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組

圖3 4組小鼠肺組織中p-AMPK的表達

*：與正常對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

3 討論

哮喘是最常見的慢性非傳染性疾病之一，其特征為炎癥細胞浸潤、氣道黏膜水腫、氣道上皮剝脫、膠原沉積和反復發(fā)作的氣道阻塞[5]。哮喘發(fā)病過程分泌大量的Th2類細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13，這些細胞因子能夠趨化嗜酸性粒細胞等炎癥細胞，導致氣管和氣道黏膜下炎癥細胞浸潤，誘導氣道平滑肌收縮，誘發(fā)哮喘臨床癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠抑制哮喘小鼠肺部炎癥細胞浸潤，下調(diào)BALF中炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13的水平，減輕肺部病理改變以及氣道高反應性，提示梓醇具有抑制哮喘氣道炎癥的作用。

哮喘進展過程中，由炎癥細胞活化產(chǎn)生的過量ROS發(fā)揮著關鍵作用。ROS觸發(fā)細胞膜上多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，生成MDA等脂質(zhì)過氧化物。MDA水平越高，代表ROS水平越高，機體損傷越重。正常條件下，機體通過抗氧化酶如SOD等降低ROS水平[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中ROS和MDA含量升高，而SOD活性下降，表明哮喘小鼠肺部存在氧化應激，而梓醇能夠提高哮喘小鼠肺部SOD活性，降低ROS和MDA含量，提示梓醇能夠減輕哮喘小鼠肺部氧化應激反應。

機體內(nèi)存在調(diào)控ROS的多條信號，如核因子E2相關因子2和AMPK等。AMPK是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，是細胞能量代謝和氧化還原的感受調(diào)節(jié)器，具有調(diào)節(jié)氧化應激、抗增殖重塑等生物學功能，是治療多種疾病的潛在靶位[6]。Faubert等[7]研究表明，AMPK缺陷的小鼠胚胎成纖維細胞線粒體中ROS水平迅速升高。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)梓醇治療后哮喘小鼠肺組織中AMPK磷酸化水平升高，提示梓醇可能通過上調(diào)AMPK活性來降低ROS水平。ROS在細胞內(nèi)信號傳導和許多轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，包括缺氧誘導因子-1α、NF-κB和激活蛋白1[8]。NF-κB存在于大多數(shù)細胞類型中，并且在免疫和炎癥反應中發(fā)揮重要作用。炎癥條件下，NF-κB由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核中，調(diào)控多種編碼炎癥蛋白的靶基因轉(zhuǎn)錄，如炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13[5]。本研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠抑制哮喘小鼠肺組織中NF-κB(p65)的表達，提示梓醇可能通過下調(diào)ROS水平抑制NF-κB(p65)的表達。

綜上所述，梓醇可通過下調(diào)AMPK的表達調(diào)控ROS的生成，減輕哮喘小鼠肺部氧化應激反應，并通過ROS/NF-κB信號通路調(diào)控哮喘小鼠氣道炎癥因子的釋放，抑制哮喘氣道炎癥。