環境微生物快速鑒定與檢測技術研究進展

摘 ?要：微生物廣泛分布于水、空氣、土壤等多種環境介質中，并在其中發揮重要作用。當今微生物分析標準主要方法仍是傳統的培養方法，然而，培養法存在培養周期長、特異性差、敏感度不高、無法檢測活的非可培養態細菌^[1]。如何準確、快速、有效地對不同環境介質中微生物進行鑒定與監測，已經成為國內外微生物研究領域的熱點。本文綜述目前環境領域的微生物鑒定與監測技術，對不同方法進行比較分析，旨在分析各種方法的利弊，為有效獲取微生物監測數據提供依據。

關鍵詞：環境;微生物;鑒定;監測

中圖分類號：Q938?文獻標識碼：A ?文章編號：1671-2064（2019）16-0000-00

1 微生物定性定量分析

用于微生物定性定量分析方法包括聚合酶鏈反應（PCR）、熒光定量PCR（qPCR）、數字PCR（dPCR）和熒光原位雜交（FISH）等。

1.1 PCR

常規的PCR主要是基于溫度變化時DNA鏈“變性-復性-延伸”的原理，通過設計特異性的引物，對目標微生物的特征基因片段進行擴增，從而判定樣品中是否含有某類微生物及其濃度。PCR擴增的終產物可根據后續電泳條帶位置和亮度進行定性和半定量分析。

1.2 qPCR

熒光定量PCR技術在PCR體系中加入熒光探針或熒光染料，利用熒光信號變化實時監測PCR擴增過程中每一輪循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線對起始模板進行相對和絕對定量。優點是靈敏度更高，特異性更強，實現實時定量分析。Knappik等比較細菌培養法和qPCR等方法在檢測老撾土壤和水體中類鼻疽伯克霍爾德桿菌的差異^[2]。結果表明對于土壤和水體樣品，經富集培養后使用qPCR法的樣品陽性檢出率顯著高于單獨培養法和單獨qPCR法。

1.3 dPCR

qPCR依賴擴增曲線Ct值定量，受不同樣品間擴增效率影響較大，而dPCR不依賴于Ct值即可進行定量。原理是將DNA樣本溶液隨機分配到大量獨立反應單元，在每個反應單元進行PCR擴增，根據泊松公式通過統計反應單元熒光信號來定量DNA。Doi等比較使用液滴數字PCR（ddPCR）和qPCR技術檢測池塘中侵入性藍鰓太陽魚的環境DNA（eDNA）^[3]。表明使用ddPCR比qPCR有更高的檢出率，ddPCR對水體中存在的有機質PCR抑制物有更好的抵抗性能，在eDNA檢測方面比熒光定量PCR更具優勢。

1.4 FISH

FISH利用非放射性熒光物質標記的DNA或RNA序列作為探針，按照堿基互補原則，與待測樣品的DNA或RNA進行特異性結合，再通過熒光顯微鏡等觀察研究微生物特定核苷酸序列的存在、數目和定位^[4]。FISH具有快速、可原位和定量分析等優點，但由于細菌普遍存在的自發熒光現象可能導致假陽性結果^[5]。

2 微生物群落結構分析

用于微生物群落結構分析的方法較多，比較常見的有傳統變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性酶切片長度多態性（T-RFLP）等方法。近年來，高通量測序技術（High Thoughput Sequencing）迅猛發展，逐漸成為微生物群落結構分析的主要研究手段。

2.1 DGGE

DGGE技術是在普通凝膠電泳基礎上發展起來的DNA分離技術，最早由Lerman等提出^[6]。主要原理是堿基序列存在差異的DNA在含不同濃度變性劑的聚變稀酰胺凝膠中解鏈行為不同，根據電泳遷移速率的變化，可以將片段大小完全相同、僅堿基組成不同的DNA片段分開。經DGGE變性分離的DNA條帶割膠回收后可以進行圖譜聚類分析或序列分析^[7]。在微生物群落結構及多樣性分析研究中，普遍采用PCR-DGGE是先將提取的樣品DNA進行PCR擴增后，再進行DGGE分離、測序。DGGE也存在如下缺點：

1. 實驗步驟較為繁瑣，摸索最適實驗條件耗時較長;
2. 由于16SrDNA不同拷貝之間的多態性，易導致對種群細菌豐度的高估;
3. 只有占群落細菌數量一定比例的類群才能被DGGE檢測;
4. 對DGGE條帶中微生物分類鑒定還需要進行條帶切割、PCR擴增、分子克隆并測序，由于分辨率低，所割取的亮帶常包含兩種以上微生物^[8]。

2.2 T-RFLP

利用T-RFLP技術分析微生物群落，首先確定目標DNA片段，根據目標基因上的保守區域設計一對引物，其中一個引物的5末端用熒光物質標記。然后提取待測樣品總DNA，經PCR擴增后，擴增產物的一端帶有這種熒光標記物。再利用適當的限制性內切酶消化PCR擴增產物，獲得長短不一的限制性片段（T-RFs），通過DNA測序儀對末端帶有熒光標記物的片段進行檢測。由于核苷酸序列具有多態性，不同長度的末端限制性片段可代表不同的微生物，而相同長度的末端限制性片段則代表至少一種微生物的存在，因此T-RFLP技術可以用來反映微生物菌落組成的情況^[9]。T-RFLP技術具有分辨率高、簡單快速、易于實現自動化等特點。但T-RFLP實驗過程中影響因素眾多，樣品總DNA提取、PCR條件優化以及限制性內切酶的選擇均對結果產生影響^[10]。此外，T-RFLP圖譜中每個T-RFs可能不止對應一個菌種，易造成對細菌種群多樣性的低估^[11]。

儲昭瑞等通過對SILVA（R108） SSU Ref數據庫中400條厭氧氨氧化菌16S rRNA基因序列的分析^[12]，建立了厭氧氨氧化菌特異性T-RFLP方法。該方法能夠有效、穩定地應用于環境樣品中厭氧氨氧化菌群落組成的快速分析。Aida等使用T-RFLP和高通量測序技術在上升流厭氧污泥床反應器處理城市污水過程中研究厭氧硫氧化和微生物多樣性的關系^[13]。

2.3 高通量測序

最早的第一代測序（First Generation Sequencing， FGS）技術由Wu等提出^[14-16]。Margulies等在Nature發表“Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors”一文^[17]，標志著高通量測序技術時代的到來。又稱第二代測序（NGS）技術，該技術一次可對上百萬條DNA分子進行序列測定，通量高，信息量大。

目前高通量測序技術已經發展到第三代（TGS）。最大特點是單分子測序技術（SMS），測序無需經過PCR擴增過程。Harrs等在Science首次報道他們開發的真正單分子測序技術（TSMS）^[18]，原理是在隨機打斷的待測DNA樣品片段末端添加poly（A），然后與檢測芯片的poly（T）雜交、定位，并逐一加入熒光標記的末端終止子，洗滌、采集熒光信號后，切開熒光染料和抑制基團，再洗滌、加帽，摻入下一個核苷酸，進行下一輪反應，最終獲得完整的序列信息。其后，Pacific Biosciences 公司推出了單分子實時技術（SMRT），該方法在聚合反應的同時就可以讀取測序產物，其測序速度快，并且具有讀數超長的優點^[19]。目前關于高通量測序技術的研究層出不窮，如何降低測序成本，快速對海量測序數據信息進行分析是今后的研究重點。

參考文獻

[1]Salma M.， Rousseaux S.， Sequeira-Le Grand A.， et al. Characterization of the Viable but Nonculturable （VBNC） State inSaccharomyces cerevisiae[J].Plos one.2013，8（10）：e77600.

[2]Knappik?M.， Dance D A B.， Rattanavong S.， et al. Evaluation of Molecular Methods to Improve the Detection ofBurkholderia pseudomalleiin Soil and Water Samples from Laos[J].Applied and Environmental Microbiology.2015，81（11）：3722-3727.

[3]Doi H.， Takahara T.， Minamoto T.， et al. Droplet Digital Polymerase Chain Reaction （PCR） Outperforms RealTime PCR in the Detection of Environmental DNA from an Invasive Fish Species[J].Environmental Science & Technology.2015，49（9）：5601-5608.

[4]李冰冰，肖波，李蓓等.FISH技術及其在環境微生物監測中的應用[J].生物技術，2007，17（5）：94-97.

[5]陳瑛，任南琪，李永峰等.微生物熒光原位雜交（FISH）實驗技術[J].哈爾濱工業大學學報，2008，40（4）：546-549.

[6]Lerman L S.， Fischer S G.， Hurley I.，et al.Sequence-determined DNA Separations[J].Annual Review of Biophysics and Bioengineering.1984，13：399-423.

[7]盧永，陳秉娟，申世峰等.PCR-DGGE在水處理微生物群落多樣性分析中的應用[J].化學與生物工程.2009，26（5）：55-59.

[8]張珍妮，吳曉芙，陳永華等.DGGE技術在環境微生物多樣性研究中的應用[J].生物技術通報.2009，（12）：48-52.

[9]羅劍飛，林煒鐵，任杰等.T-RFLP技術及其在硝化細菌群落分析中的應用[J].微生物學通報.2008，35（3）：456-461.

[10]羅佳捷，李麗立，張彬等.T-RFLP技術及其在微生物群落結構研究中的應用[J].中國畜牧獸醫.2009，36（7）：75-78.

[11]余素林，吳曉磊，錢易等.環境微生物群落分析的T-RFLP技術及其優化措施[J].應用與環境生物學報.2006，12（6）：861-868.

[12]儲昭瑞，李相昆，孟令威等.T-RFLP技術在厭氧氨氧化菌群結構分析中的應用[J].哈爾濱工業大學學報.2013，45（2）：26-30.

[13]Aida AA.，Kuroda K.，Yamamoto M.，Nakamura A.，Hatamoto M.，Yamaguchi T. Diversity Profile of Microbes Associated with Anaerobic Sulfur Oxidation in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor Treating Municipal Sewage[J].Microbes and Environments.2015，30（2）：157-163.

[14]Wu R.，Kaiser A D.Structure and Base Sequence in the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda DNA[J].Journal of Molecular Biology.1968，35（3）：523-537.

[15]Wu R.Nucleotide Sequence Analysis of DNA.?I.?Partial Sequence of the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda and 186 DNA[J].Journal of Molecular Biology.1970，51（3）：501-521.

[16]Wu R.，Taylor E. Nucleotide Sequence Analysis of DNA.?II. Complete Nucleotide Sequence of the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda DNA[J].Journal of Molecular Biology.1971，57（3）：491-511.

[17]Margulies M.， Egholm M.， Altman W E.， et al. Genome Sequencing in Microfabricated High-density Picolitre Reactors[J].?Nature.2005，437（7057）：376-380.

[18]Harris T D.， Buzby P R.， Babcock H.， et al. Single-molecule DNA Sequencing of a Viral Genome[J]. Science. 2008，320（5872）：106-109.

[19]Eid J.， Fehr A.， Gray J.， et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules[J]. Science.2009，323（5910）：133-138.

收稿日期：2019-06-26

作者簡介：吳根英（1986—），女，浙江龍泉人，碩士，工程師，研究方向：環境保護。