EGCG對電離輻射所致豚鼠聽功能和耳蝸毛細胞損傷的影響

徐亞雄 羅香林 豐俊 李楚凌

【摘要】 目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對電離輻射所致豚鼠聽功能和耳蝸毛細胞損傷的保護作用。方法 24只豚鼠， 按照隨機數字表法分為對照組、EGCG+輻射組及輻射組， 每組8只。EGCG+輻射組及輻射組于造模前3 d開始腹腔注射EGCG（25 mg/1000 g）及等量的生理鹽水，?2次/d;對照組不做任何處理。在照射前第4天及照射后第8天檢測所有豚鼠的聽覺腦干誘發電位（ABR）閾值， 照射8 d后于顯微鏡下計數毛細胞數量。比較三組的ABR閾值檢測結果、耳蝸鋪片及細胞計數。結果 干預后8 d， EGCG+輻射組ABR閾值（38.1±3.3）dB低于輻射組的（49.4±8.6）dB， 差異具有統計學意義（P<0.05）;干預后8 d， EGCG+輻射組和輻射組的ABR閾值與干預前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB對比明顯升高， 差異具有統計學意義（P<0.05）。輻射組實驗動物的耳蝸毛細胞數量降低， 形態改變， 排列雜亂不齊， 造模成功;EGCG+輻射組顯微鏡鏡檢表明耳蝸毛細胞數與對照組相比有所降低， 排列較為雜亂， 但與輻射組相比形態結構較好。對照組耳蝸毛細胞計數為（1102.23±80.55）個， EGCG+輻射組耳蝸毛細胞計數為（758.56±143.27）個， 輻射組耳蝸毛細胞計數為（527.00±165.23）個， EGCG+輻射組、輻射組耳蝸毛細胞計數均低于對照組， 輻射組耳蝸毛細胞計數低于EGCG+輻射組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。結論 對豚鼠預防性注射EGCG能夠有效降低電離輻射對聽功能和耳蝸毛細胞損傷作用， 對電離輻射所致的聽力損傷具有一定的防護作用。

【關鍵詞】 表沒食子兒茶素沒食子酸酯;電離輻射;豚鼠;聽功能;耳蝸毛細胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.29.111

目前， 臨床針對惡性腫瘤的治療， 已經逐漸將電離輻射作為常用治療手段， 但是在治療的過程中， 該治療手段容易對患者造成一定負性影響， 如導致其細胞、非靶組織出現嚴重受損的情況。其中對于頭頸部腫瘤患者來說， 在進行放射治療中最為常見的一種并發癥便是感音性耳聾（SNHL）。且目前已有相關研究表明輻射對耳蝸毛細胞具有損傷作用， 能夠改變毛細胞的形態[1]。綠茶提取物——EGCG的化學結構中存在較多的酚羥基， 具有較強的抗氧化能力[2];EGCG能夠通過抑制炎性因子及纖維化調節因子等轉錄分泌， 緩解肝臟中CCl4所導致的氧化應急反應[3]。因此， 抗氧化劑EGCG對電離輻射所致的耳蝸損傷的作用具有較高的研究價值。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取24只雄性健康成年豚鼠作為研究對象， 體重300～350 g， 耳廓反射檢查正常， 由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供;按照隨機數字表法分為對照組、EGCG+輻射組及輻射組， 每組8只。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 耳蝸損傷模型的建立 EGCG+輻射組及輻射組采用10%水合氯醛麻醉后， 固定于鼠板上， 采用自制的“U”形夾頭鉛板遮蔽豚鼠非處理部分， 60Co遠距離治療機對實驗動物進行一次性的60Co照射70 Gy， 照射深度為2.0 cm， 照射范圍以耳蝸為中心的2 cm×2 cm范圍內;對照組豚鼠不做處理。輻射組檢測ABR閾值高于對照組則表明耳蝸損傷模型造模成功。

1. 2. 2 給藥方法 EGCG+輻射組及輻射組于造模前3 d開始腹腔注射EGCG（25 mg/1000 g）及等量的生理鹽水， 2次/d;對照組不做任何處理。

1. 2. 3 ABR檢測 在照射前第4天及照射后第8天檢測所有豚鼠的ABR， 采用10%水合氯醛麻醉。以實驗動物顱頂正中皮下作為正極， 給聲側耳廓后作為負極。對實驗動物進行以2000 Hz為主的短聲進行刺激， 刺激間隔時間為90 ms， 帶通濾波50～3000 Hz， 共刺激200次， 掃描時程為20 ms。聲波開始強度以95 dB開始， 并以5 dB為梯度逐漸降低， 觀察P3波以確定實驗動物兩耳的ABR閾值。

1. 2. 4 耳蝸鋪片觀察毛細胞組織結構及計數 照射8 d后刺死動物同時取右側聽泡打開， 于蝸尖處開孔， 以暴露卵圓窗和圓窗。蝸尖采用0.5%的硝酸銀溶液沖洗2～3次， 隨后采用10%的多聚甲醛灌入后日光下曝光2～3 h， 取基底膜于100倍光鏡下觀察毛細胞組織結構及計數， 由底回段到頂回段逐級計數， 計數各回段每排毛細胞在單位長度內的個數， 各回段計數總和即為毛細胞總數。

1. 3 觀察指標 比較三組的ABR閾值檢測結果、耳蝸鋪片及細胞計數。

1. 4 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 三組ABR閾值檢測結果對比 干預后8 d， EGCG+輻射組ABR閾值（38.1±3.3）dB低于輻射組的（49.4±8.6）dB， 差異具有統計學意義（P<0.05）;干預后8 d， EGCG+輻射組與輻射組的ABR閾值與干預前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB對比明顯升高， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 三組耳蝸鋪片及細胞計數對比 耳蝸鋪片顯微鏡計數檢查表明， 輻射組實驗動物的耳蝸毛細胞數量降低， 形態改變， 排列雜亂不齊， 造模成功;EGCG+輻射組顯微鏡鏡檢表明耳蝸毛細胞數與對照組相比有所降低， 排列較為雜亂， 但與輻射組相比形態結構較好。對照組耳蝸毛細胞計數為（1102.23±80.55）個， EGCG+輻射組耳蝸毛細胞計數為（758.56±143.27）個， 輻射組耳蝸毛細胞計數為（527.00±165.23）個， EGCG+輻射組、輻射組耳蝸毛細胞計數均低于對照組， 輻射組耳蝸毛細胞計數低于EGCG+輻射組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

放射治療是現階段鼻咽癌、腮腺癌等頭頸部惡性腫瘤使用較多的常規治療方式， 主要放射治療區域包括耳在內的顳骨區。在針對患者進行臨床治療時， 患者存在不同程度的聽力降低情況， 通過進行動物實驗發現常規治療劑量的放射線， 便會對內耳耳蝸造成一定程度損傷， 導致患者聽力下降[4]， 另外相關研究進一步證明， 內耳損傷的程度與放射劑量相關， 現階段多認為放射劑量達到60 Gy時即可導致內耳出現損傷， 為頭頸部惡性腫瘤最常見的并發癥之一， 現階段臨床中多以50 Gy為內耳損傷的劑量臨界值[5]。EGCG為茶多酚中抗氧化作用最高的成分之一， 該物質的化學結構中富含酚羥基， 其抗氧化能力為超氧化物歧化酶的6倍、維生素E的20倍， 具有較強的抗炎、清除機體自由基以及對神經系統的保護等多種作用[6]。

本研究采用EGCG對電離輻射大鼠進行干預， 結果表明：干預后8 d， EGCG+輻射組ABR閾值（38.1±3.3）dB低于輻射組的（49.4±8.6）dB， 差異具有統計學意義（P<0.05）;干預后8 d， EGCG+輻射組和輻射組的ABR閾值與干預前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB對比明顯升高， 差異具有統計學意義（P<0.05）。輻射組實驗動物的耳蝸毛細胞數量降低， 形態改變， 排列雜亂不齊， 造模成功;EGCG+輻射組顯微鏡鏡檢表明耳蝸毛細胞數與對照組相比有所降低， 排列較為雜亂， 但與輻射組相比形態結構較好。對照組耳蝸毛細胞計數為（1102.23±80.55）個， EGCG+輻射組耳蝸毛細胞計數為（758.56±143.27）個， 輻射組耳蝸毛細胞計數為（527.00±165.23）個， EGCG+輻射組、輻射組耳蝸毛細胞計數均低于對照組， 輻射組耳蝸毛細胞計數低于EGCG+輻射組， 差異均具有統計學意義（P<0.05）。

綜上所述， 對豚鼠預防性注射EGCG能夠有效降低電離輻射對聽功能和耳蝸毛細胞損傷作用， 對電離輻射所致的聽力損傷具有一定的防護作用。

參考文獻

[1] 楊襯， 張威， 劉小龍， 等. 單次不同放射線劑量和時間對Balb/c小鼠耳蝸顯微和超微結構的影響. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2014， 28（13）：979-982.

[2] 劉婷婷， 孟馨. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯抗氧化作用機制的研究進展. 現代藥物與臨床， 2016， 31（6）：919-923.

[3] 羅可望， 龍穎妍， 黃衛人. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯抗腫瘤作用的研究進展. 醫學綜述， 2017， 23（10）：1929-1934.

[4] 趙向東， 梁勇， 任陳， 等. 不同劑量放射線對小鼠畸變產物耳聲發射和外毛細胞Prestin蛋白表達的影響. 聽力學及言語疾病雜志， 2013， 21（3）：267-271.

[5] 文果， 覃玉桃. 鼻咽癌治療相關聽力損傷研究進展. 中華耳科學雜志， 2018， 16（5）：640-645.

[6] 嚴正強， 陳鐵定， 陳力， 等. 茶多酚對人前列腺癌PC-3M細胞侵襲力的影響. 浙江醫學， 2017， 39（12）：946-951.

[收稿日期：2019-02-14]