催化還原-管內固相微萃取-毛細管液相色譜系統用于二硝基芘同分異構體的分析

李軻　王昱　嚴勇　趙蕾　張東堂　王亞楠　郭廣生　汪夏燕

摘 要 構建了催化還原-管內固相微萃取-毛細管液相色譜聯用（CR-IT-SPME-CLC）體系，用于3種二硝基芘（DNP）同分異構體的快速分離分析。以Pt/Al2O3為催化劑，以甲酸銨為供氫體，在95℃的條件下，采用催化氫化的方法實現了3種DNP樣品的高效還原。通過優化預聚合溶液組成，利用自制的毛細管旋轉裝置制備了還原氧化石墨烯均勻分布且滲透性良好的納米材料共聚管內固相微萃取整體柱。優化了固相微萃取的解析液條件，實現了3種DNP還原產物二氨基芘的高效萃取，萃取效率可達82.48%～91.65%。以粒徑為5 μm的C18為填料，采用高壓勻漿填充法制備了毛細管色譜填充柱，并以此構建了毛細管液相色譜-激光誘導熒光檢測（CLC-LIF）系統。通過優化色譜分離條件，在10 min內實現3種二氨基芘的完全分離。本方法操作簡單、快速、靈敏，適合于硝基多環芳烴中DNP同分異構體的分析。

關鍵詞 毛細管旋轉裝置; 二硝基芘同分異構體; 催化還原; 管內固相微萃取; 毛細管液相色譜-激光誘導熒光檢測

1 引 言

硝基多環芳烴（Nitro-PAHs）是一類持久性有機污染物[1]，主要來源于化石燃料和生物質的不完全燃燒，以及多環芳烴（PAHs）與大氣介質（NO2、NO3和HNO3等）的光化學反應[2]。雖然環境中硝基多環芳烴的濃度低于多環芳烴，但其致突變性、致畸性和致癌性都是其母體多環芳烴的數十甚至數萬倍[3，4]，其中含有4個芳香環的硝基多環芳烴則具有更強的毒性效應[5]，如二硝基芘（DNP）的同分異構體： 1，3-二硝基芘（1，3-DNP）、1，6-二硝基芘（1，6-DNP）和1，8-二硝基芘（1，8-DNP）等。2012年，國際癌癥研究中心將3種二硝基芘異構體列入可能的人類致癌物名單中[6]。3種二硝基芘異構體雖然具有相似的化學結構，但其對生態環境的影響并不相同，1，6-DNP和1，8-DNP的急性毒性約為1，3-DNP的3～4倍[7]。 然而，目前針對3種DNPs同分異構體的分析仍鮮有報道。

環境中nitro-PAHs分析方法主要包含兩個步驟： 樣品前處理過程和分析檢測過程[8]。Nitro-PAHs的含量極低，且成分復雜，需要高效的萃取方法。管內固相微萃取（IT-SPME）是Eisert等[9]提出的一種樣品前處理技術，具有操作方法簡便、高效、試劑消耗少、易與其它儀器聯用的特點，廣泛應用于生物分析[10，11] 、食品安全[12]和環境監測[13]等領域。IT-SPME技術已被成功應用于PAHs的萃取分析中[14]，但其在含量低但毒性更大的nitro-PAHs分析中的應用仍鮮有報道。石墨烯是一種由碳原子構成的單層片狀結構的二維材料，具有比表面積大、疏水性強、化學穩定性好的優點[15]，已被廣泛應用于多環芳烴[16]和酰胺類除草劑[17]等的萃取分析中。氧化石墨烯（GO）表面含有親水性的含氧官能團，被還原后生成還原氧化石墨烯（rGO）， rGO的親水性變差，疏水性增強[18]，因而適于疏水性nitro-PAHs的萃取富集，但是，rGO易在固相微萃取整體柱的制備過程產生沉積，不利于其在整體柱中的均勻分布，影響萃取效果。因此，需要建立一種rGO可均勻分布的整體柱制備方法。

Nitro-PAHs樣品經過前處理過程后，通常采用氣相色譜法[19]或高效液相色譜法[20]對檢測物進行分離，然后通過熒光[21]、化學發光[22]、質譜[23]或電化學檢測方法[24]等對其進行定性或定量分析。在高溫條件下，nitro-PAHs不穩定，易分解，因此高效液相色譜法是分離nitro-PAHs最常用的方法。電化學檢測法靈敏度高，但流動相易在電極表面發生電化學反應，產生背景電流[22]。質譜檢測法可用于未知結構硝基多環芳烴的檢測，但昂貴且體積大的儀器不能滿足現場分析的需求。熒光檢測法和化學發光檢測法選擇性好，靈敏度高，且具有較低的檢測限，但化學發光法的應用范圍受到一定的限制。Nitro-PAHs分子中由于硝基官能團的強吸電子特性，使其在熒光檢測器中響應微弱，但當nitro-PAHs上的硝基還原為氨基之后，其熒光響應信號大幅增強。Hasei等[25]使用一個硅膠柱和兩個反相C18色譜柱對土壤和大氣顆粒物中收集的3，6-二硝基苯并[e]芘樣品進行萃取，并通過在線還原-高效液相色譜-熒光檢測法進行定量分析。該方法前處理過程復雜，耗時較長，且未用于多組分硝基多環芳烴的同時分析。Watanabe等[26]采用高效液相色譜-熒光檢測方法分離檢測了3種DNP同分異構體，但該方法使用商業化的不銹鋼色譜柱，分析時間較長，且未實現3種樣品的完全分離。目前，仍缺乏一種高效、靈敏、快速且操作方便的方法用于多組分硝基多環芳烴的分析。

本研究建立了一種集樣品預處理與分離檢測于一體的多種nitro-PAHs同分異構體的分析方法。采用催化氫化方法還原3種DNPs同分異構體，并利用構建的IT-SPME-CLC-LIF系統分析了DNPs的還原產物二氨基芘（DAPs）。使用毛細管旋轉裝置制備了rGO均勻分布的管內固相微萃取柱，提高了萃取效率; 以實驗室自制的毛細管填充柱為分離柱，建立了CLC-LIF系統，實現了3種DAPs的快速分離檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CBIO-UV8D紫外光反應箱（北京賽百奧科技有限公司）; 熔融石英毛細管（25 μm i.d.和100 μm i.d.，美國Polymicro Technologies公司）; KQ2200B超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）; 旋渦振蕩器（IKA集團）; HITACHI S-4300掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

甲基丙烯酸正丁酯（n-BMA， 99%）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA， 99%）、3-（三甲氧基甲硅基）甲基丙烯酸丙酯（γ-MAPS， 98%）、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA， 99%）（百靈威科技有限公司）; N，N-二甲基甲酰胺（DMF， 99%）、丙酮、HCl、NaOH、H3PO4、二氯甲烷（分析純，北京化工廠）; 熒光素鈉（分析純，北京伊諾凱科技有限公司）;? rGO（美國Graphene 3D Lab）; 聚乙二醇-6000、乙腈、乙酸（分析純，天津市福晨化學試劑廠）; 甲醇（99.9%，天津市四友精細化學品有限公司）; 甲酸銨（98%，國藥集團化學試劑有限公司）; 氧化鋁載鉑（5%，Alfa Aesar公司）; 1，3-DNP、1，6-DNP、1，8-DNP（美國Accustandard公司）; 1，3-DAP、1，6-DAP、1，8-DAP（98%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司）。實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm，美國Thermo Scientific公司純水機制備）。

1.0 g/L DNP儲備液制備：取5.0 mg DNP樣品，加入5.0 mL二氯甲烷，超聲振蕩均勻，于4℃條件下儲存; 500.0 mg/L DAP儲備液制備：取5.0 mg DAP樣品，加入10.0 mL甲醇，超聲振蕩均勻，于4℃條件下儲存。

2.2 搭建毛細管旋轉裝置

毛細管旋轉裝置包括旋轉電機（含毛細管固定裝置）、固定旋轉電機底座、

旋轉電機控制裝置和控制毛細管旋轉范圍的擋板共4部分，其裝置結構如圖1所示[27]。具體操作過程如下：毛細管沿旋轉電機主軸方向放置，兩端分別由旋轉電機和擋板固定，調節控制裝置的轉速可以實現毛細管旋轉。改變電機連接的固定裝置，可實現多根毛細管同步旋轉（見電子版文后支持信息圖S1所示）。通過改變擋板與固定裝置之間的距離實現不同長度毛細管的旋轉。

2.3 制備IT-SPME整體柱

在熔融石英毛細管內（100 μm i.d.; 360 μm o.d.）通過深紫外光引發聚合方法制備聚甲基丙烯酸正丁酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯-還原氧化石墨烯（BMA-EDMA-rGO）整體柱。制備整體柱前，首先使用γ-MAPS對毛細管內壁進行乙烯化處理[28]。取BMA（300.0 mg）、EDMA（200.0 mg）、DMF（400.0 mg）、PEG-6000（100.0 mg）、rGO（1.0 mg）和DMPA（5.0 mg）配制預聚合溶液。預聚合溶液經渦旋振蕩、超聲處理后，注入到乙烯化的毛細管中，使用硅橡膠密封毛細管兩端，將該毛細管固定在毛細管旋轉裝置中，置于紫外反應箱（CBIO-UV8D，254 nm，18 W）中聚合反應約 25 min; 最后用甲醇沖洗毛細管，以去除未反應的單體和致孔劑。

2.4 制備色譜分離填充柱

自制的毛細管填充柱以反相C18固定相為填料，以帶有篩板的二通為柱塞，在石英毛細管（100 μm i.d.; 360 μm o.d.）中通過勻漿填充法制備毛細管色譜分離柱。將C18固定相顆粒分散于丙酮中， 形成勻漿液（20 mg/mL）， 并轉移到毛細管柱制柱機中，通過色譜泵將C18顆粒填充入毛細管中，當填充柱長度達到20 cm時關閉色譜泵，然后取下填充好的毛細管并連接另一端的柱塞，最后用高壓色譜泵對毛細管填充柱進行壓實。

2.5 DNP的還原

參照并改進了文獻[24]中催化氫化的方法對DNP樣品進行還原（實驗裝置如電子版文后支持信息圖 S2A所示）。 將1.0 mg Pt/Al2O3催化劑和50.0 μL DNP樣品（1.0 μg/mL; 溶劑為含5.0 mg/mL甲酸銨的80%甲醇溶液）置于離心管中，超聲混合均勻，然后將離心管置于一個不銹鋼瓶中，于100 psi（約0.69 MPa）壓力下用氮氣流加壓2 min，置于95℃水浴中反應2 h。最后，將離心管中的溶液離心，收集上清液，檢測還原后上清液以及相同濃度DAP樣品的熒光強度，按式（1）計算還原效率（Re）：

R_e（%）=（A₁/A₂）×100%（1）

其中， A1是還原后上清液的峰面積; A2是相同濃度DAP樣品的峰面積。

2.6 DAP的萃取

萃取過程包括預處理、萃取、洗滌和解析4個步驟。萃取實驗裝置示意圖如電子版文后支持信息圖S2B所示。過程如下： （1）預處理 采用甲醇沖洗聚（BMA-EDMA-rGO）整體柱進行預處理; （2）萃取在400 psi （約2.76 MPa）氮氣流壓力下將20.0 μL 5.0 μg/mL DAP樣品加載到萃取柱上，并收集流出液; （3）洗滌 在400 psi氮氣流壓力下，用10.0 μL超純水沖洗萃取柱，以洗除雜質，并收集流出液; （4）解析 在400 psi氮氣流壓力下，將20.0 μL解析溶液注入萃取柱，以洗脫樣品，并收集流出液; 最后，在相同條件下，檢測5.0 μg/mL DAP標準樣品和萃取實驗所有收集溶液的熒光信號，按式（2）計算萃取效率（Ee）：

E_e（%）=（A₃/A₄）×100%（2）

其中，A3是解析后收集溶液的峰面積; A4是DAP標準樣品的峰面積。

2.7 DAP的色譜分離

采用搭建的CLC-LIF系統（見電子版文后支持信息S3）進行色譜分離。通過等度洗脫模式進行色譜分離，以乙腈-水為流動相，其中乙腈的濃度范圍是50%～70%（V/V）; 采用H3PO4調整流動相至pH 3.7～5.1， 流動相流速300～500 nL/min。采用熒光檢測，激發波長375 nm，發射波長405 nm。

3 結果與討論

3.1 IT-SPME整體柱的表征

預聚合溶液的組成影響聚（BMA-EDMA-rGO）整體柱的形貌、 結構及滲透性，其組成的優化方案見電子版文后支持信息表S1。通過掃描電鏡對所制備的整體柱進行了表征（電子版文后支持信息圖S4）。表S1中，1號預聚合溶液所制備的整體柱不能形成均一致密的結構，并且整體柱柱體不能良好地結合到管壁上。與2號預聚合溶液相比，3號預聚合溶液所制備的整體柱結構更加致密均勻，具有較大的比表面積，可以提高萃取效率，連續的大孔結構可確保較高的滲透性。因此，最終選擇的預聚合溶液組成是：BMA（300.0 mg）、EDMA（200.0 mg）、DMF（400.0 mg）、PEG-6000（100.0 mg）、rGO （1.0 mg）和DMPA（5.0 mg）。

為了實現rGO在聚合物基體中的均勻分散，采用實驗室自制的毛細管旋轉裝置制備整體柱。圖2A是在水平靜置條件下所制備整體柱的顯微鏡圖片，可見明顯分層結構，黑色的rGO多沉積于毛細管底部。由圖2B可見，通過毛細管旋轉裝置所制備整體柱中rGO片層可均勻地分布在聚合物基體中。通過比較靜置與旋轉狀態下所制備的整體柱的形貌 （圖2C和2D），其整體形貌無明顯差別，毛細管旋轉裝置對整體柱聚合過程無明顯影響，但是從圖2C明顯看出同一個截面左右出現分界區域，左邊顏色偏深，右邊顏色偏淺，這與圖2A中觀察到的分層現象一致，進一步說明水平靜置條件下所制備整體柱中rGO分布不均勻。

萃取整體柱的SEM表征結果如圖3所示。在優化的預聚合溶液組成條件下可以制備結構均勻的整體柱（圖3A），聚合物基體與毛細管內壁結合緊密（圖3B）。所制備的整體柱具有三維網狀骨架結構，由通孔和微孔構成。通孔的尺寸約5 μm（圖3C），因此具有良好的通透性，在樣品萃取過程中，有利于快速均勻地傳質。由圖3D可見到嵌入到整體柱中的rGO片層。

3.2 DNP的還原效率

DNP還原效率的測定在中空的毛細管（100 μm i.d.; 360 μm o.d.）中進行，以50%（V/V）乙腈為流動相，以LIF為檢測器，在0.14 MPa（20 psi）氮氣流壓力下驅動還原產物進行檢測。根據公式（1）計算其還原效率。3種DNP的還原效率為99.53%～110.13%（表1），說明本方法還原效率較高。

3.3 優化解析溶劑和計算DAP的萃取效率

采用與3.2節中相似的裝置檢測萃取前后的樣品。 萃取后流出溶液中未檢出樣品信號峰，說明聚（BMA-EDMA-rGO）整體柱對DAP具有較強的萃取能力。為了獲得較好的解析效率，對解析溶劑進行了優化（見電子版文后支持信息圖S5）。解析溶劑的詳細優化方案見電子版文后支持信息表S2。實驗結果表明，80%甲醇（V/V， pH=4.5）作為解析試劑時，解析效率較高。3種DAP的萃取效率在82.48%～91.65%之間（表2）。上述結果表明，聚（BMA-EDMA-rGO）整體柱對DAP具有較好的萃取性能。

3.4 色譜分離條件的優化

考察了3種流動相濃度對DAP樣品分離的影響（圖4A）。當乙腈濃度由50%（V/V）提高到70%（V/V）時，由于高比例乙腈對于DAP樣品的強洗脫能力，其在色譜柱中的保留減弱，并且隨著乙腈濃度的提高，3種DAP樣品分離度降低，因此，應選擇低濃度乙腈作為流動相。然而，由于DAP樣品與C18鏈有較強的疏水作用，隨著乙腈濃度降低，流動相洗脫能力減弱，色譜峰拖尾現象越來越嚴重。因此，本研究沒有進行更低濃度乙腈作為流動相的探索，選擇50%（V/V）乙腈作為色譜分離流動相條件繼續進行優化實驗。

流動相流速對樣品分離的保留時間和分離度具有重要影響，本研究選擇了3種流動相流速（300、 400和500 nL/min） 對于DAP樣品進行分離（圖4B）。當流動相流速由500 nL/min降低到300 nL/min時，DAP樣品與C18鏈之間的相互作用時間延長，增加了樣品的保留，色譜峰的拖尾現象嚴重，并且在低流速下其分離時間過長。然而，當流速大于500 nL/min時，分離壓力接近色譜泵的最大壓力。因此，最終采用500 nL/min的流速進行實驗樣品的色譜分離。

使用H3PO4調節流動相的pH值，考察流動相pH值對色譜分離的影響。1，3-DAP、1，6-DAP和1，8-DAP的pKa分別為5.07、4.82和4.84，因此調整流動相的pH范圍為3.7～5.1，圖4C為使用不同pH值流動相的分離結果。以1，3-DAP和1，6-DAP為例計算分離度（電子版文后支持信息表S3），結果表明，在pH=4.3的流動相條件下，3種樣品的峰形最好，兩種樣品的分離度最高（R36=2.71），而在其它pH條件下，由于3種DAP樣品質子化程度不同，影響了樣品與固定相之間的靜電作用，造成了色譜峰的展寬。綜上，得到最優的色譜分離條件為：流動相為50%（V/V）乙腈， pH=4.3，流速為500 nL/min。

3.5 IT-SPME-HPLC系統的最優分離結果

經過系統的優化分析，得到的優化分離結果如圖5所示，在10 min內實現3種DAP同分異構體的完全分離，其中1，3-DAP、1，6-DAP和1，8-DAP的理論塔板數依次為12272、9121和10979 plates/m。3種DAP樣品的分離度分別是R36=3.95、R68=2.16和R38=1.80。1，3-DAP和1，6-DAP之間的分離度RSD=2%（n=3）。本系統可實現DAP同分異構體的快速分離與分析。

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Catalytic Reduction-In-Tube Solid Phase Microextraction-Capillary

Liquid Chromatography System for Analysis of Dinitropyrene Isomers

LI Ke， WANG Yu， YAN Yong， ZHAO Lei， ZHANG Dong-Tang， WANG Ya-Nan， GUO Guang-Sheng， WANG Xia-Yan*

（Center of Excellence for Environmental Safety and Biological Effects， Beijing Key Laboratory for Green Catalysis and

Separation， Department of Chemistry and Chemistry Engineering，

Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）

Abstract In this study， a catalytic reduction-in-tube solid phase microextraction coupled with capillary liquid chromatography （CR-IT-SPME-CLC） system was developed for rapid analysis of dinitropyrene isomers （DNPs）. Pt/Al2O3 and ammonium formate were used as catalyst and hydrogen donor respectively， and three DNPs were reduced efficiently by catalytic hydrogenation at 95℃. A solid phase microextraction monolithic column embedded into nanomaterial with uniform distribution of reduced graphene oxide and good permeability， which was prepared using self-made capillary rotating device by optimizing the composition of the pre-polymerization solution. For highly efficient extraction of three dinitropyrene reduction products， desorption solution of solid phase microextraction was optimized， and the extraction efficiency was 80.47%-93.37%. Capillary chromatography column was packed with C18 particles （5 μm） at high chromatographic pump pressure， and a capillary liquid chromatography-laser induced fluorescence detection system was established. Complete separation of three diaminopyrenes was achieved in 10 min by optimizing the chromatographic separation conditions. The proposed method is simple， rapid and sensitive for the analysis of DNP isomers among nitropolycyclic aromatic hydrocarbons.

Keywords Capillary rotating device; Dinitropyrene isomers; Catalytic reduction; In-tube solid phase microextraction; Capillary liquid chromatography-laser induced fluorescence detection.