雷帕霉素對體外培養的鼻息肉細胞增殖的影響

徐婷婷，白偉良，譚海燕，王梟維

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉科，沈陽 110004；2.鐵嶺市中心醫院耳鼻咽喉科，遼寧 鐵嶺 112000）

鼻息肉為鼻部常見疾病，鼻塞、流涕、嗅覺障礙等諸多臨床癥狀嚴重影響患者的生存質量。病因的多元性和術后復發傾向嚴重危害患者健康，迄今為止，外用和口服皮質類固醇、鼻竇手術是主要的治療手段［1-2］。鼻息肉形成是多種細胞因子協同作用的結果，很可能受基因調控，在鼻腔外側壁這個特殊微環境中表達上調，但確切機制尚未明確［3］。研究［4］表明約14%患者有鼻息肉病家族史。前期研究［5］發現PTEN/PI3K/Akt信號通路在鼻息肉中存在Akt激活。PTEN/PI3K/Akt信號通路在鼻息肉發生、發展中可能起重要作用。哺乳動物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在感受營養信號、調節細胞生長與增殖中起著關鍵性作用。mTOR作為PI3K/Akt的下游基因，其表達及活性有可能受到影響。已有研究［6］證明鼻息肉組織中PI3K、Akt和mTOR表達均上調，三者有協同表達關系，提示可能是通過PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路使炎癥細胞凋亡抑制，導致慢性炎癥反應，最終形成鼻息肉。

雷帕霉素是一種高效低毒的大環內酯類免疫抑制藥。細胞胞質內的激酶mTOR是雷帕霉素已知的主要靶體，它也是mRNA翻譯的啟動調控因子。Kip1是一種周期素依賴性激酶的抑制劑，能降低活化的T細胞內G1期的周期素與其依賴性激酶復合物的水平。雷帕霉素通過阻斷Kip1的下調而將細胞阻滯于G1期［4］。mTOR的信號通路在鼻息肉中的作用機制尚不明確，本研究探討雷帕霉素對鼻息肉細胞增殖的影響，分析mTOR信號通路在鼻息肉發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本選取

標本取自2013年11月至2015年4月期間中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉科行鼻內鏡下鼻息肉切除手術中取得的鼻息肉組織。所有鼻息肉標本均由2名病理學醫師證實，本研究符合醫學倫理學原則，并取得患者的知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼻息肉細胞原代培養：于手術室將術中的鼻息肉標本立即用生理鹽水沖洗干凈，放入培養皿中，取適量0.25%蛋白酶加入培養皿中，置4 ℃冰箱中消化20 h，加入適量胎牛血清終止消化。將細胞懸液1 500 r/min離心5 min，然后用10%胎牛血清培養基離心洗滌2次，加入適量10%胎牛血清培養基制成細胞懸液，以吸管吸少許細胞懸液（3～5滴）滴至EP管中，加入等量1%臺盼藍2 min，微量移液器吸取100 μL細胞懸液滴于蓋好玻片的細胞計數板上，觀察細胞活性并計數。臺盼藍染色證明細胞活性＞90%，稀釋細胞懸液至1×106/mL，接種于25 cm2細胞培養瓶中，置37 ℃，5%CO2細胞培養箱中孵育15～20 min。根據ABC貼壁法去除鼻黏膜上皮細胞中的大部分成纖維細胞及紅細胞，10%胎牛血清培養基培養約40 h后，更換為無血清含8種生長因子培養基（培養基中含100 UI/mL青鏈霉素，50 μg/mL慶大霉素，2.5 μg/mL兩性霉素B）。倒置顯微鏡下觀察細胞形態、增殖及生長情況，并進行拍照。

1.2.2 流式細胞術檢測：取37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下細胞貼壁生長良好的原代培養6 d的鼻息肉細胞，PBS清洗2次，棄去上清，加入適當體積的0.25%胰酶消化細胞，待細胞變圓后，加入完全培養基終止反應。收集混合液至15 mL試管，800 r/min離心3 min。將收集到的所有細胞用含5%BSA的PBS洗滌2次，800 r/min離心5 min收集細胞，每管細胞樣品中加入500 μL PBS輕輕重懸細胞。將細胞分2組，實驗組加入5 μL 細胞角蛋白抗體（Alexa Fluor?647Mouse Anti-Human Cytokeratin），混勻；對照組不做處理，37 ℃避光孵育30 min后進行流式細胞術檢測。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：以含8種生長因子的DMEM/F2（1∶1）培養基原代培養的鼻息肉細胞，取對數生長期細胞以5%蛋白酶消化后，3×103/mL的濃度接種到96孔板上，每孔200 μL，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養。取出96孔板小心吸盡每孔培養基，并加入含不同濃度雷帕霉素的培養基，每個濃度的雷帕霉素設5個復孔，6個實驗組加入雷帕霉素終濃度分別為0、3、10、100、300、1 000、3 000、10 000、30 000 ng/mL。以不加藥物的細胞懸液為陰性對照組，以不含細胞的培養基為空白組用于儀器校零。加藥后的96孔板繼續置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養48 h。向培養板中每孔加入180 μL DMEM/F2（1∶1）培養基，再加入20 μL MTT工作液（0.2 mg/mL），置于培養箱中培養4 h。取出96孔板，每孔加入200 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，將96孔板置于酶標儀上，在490 nm處測量各孔吸光值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行數據分析，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗，應用改良的寇氏法［7］計算雷帕霉素半抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50），計算細胞的抑制率。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻息肉細胞原代培養結果

結果顯示，細胞原代培養1d后開始貼壁，3～4d細胞部分融合，6～7d基本完全融合。原代培養6 d的鼻息肉細胞呈單層融合生長，大部分細胞呈鵝卵石狀（圖1A），少量梭形細胞存在，細胞分裂相明顯（圖1B），細胞呈橢圓形，細胞膜上纖毛倒伏，鏡下可見纖毛擺動，細胞核類圓形，胞質內有分泌顆粒及空泡形成（圖1C）。

2.2 流式細胞術檢測結果

圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養6 d的鼻息肉細胞的形態結構Fig.1 The morphological structure of nasal polyp cells was observed under an inverted microscope after 6 days of primary culture

結果顯示，對照組陽性細胞率為（4.8±0.9）%，實驗組陽性細胞率為（60.9±4.7）%，2組差異有統計學意義（t=26.214，P＜ 0.001）。見圖2。

2.3 鼻息肉細胞增殖及雷帕霉素IC50結果

圖2 流式細胞術鑒定結果Fig.2 Results of flow cytometry

結果顯示，陰性對照組（0 ng/mL雷帕霉素）、3、10、100、300、1 000、3 000、10 000、30 000 ng/mL雷帕霉素組細胞抑制率分別為（0.0±0.0）%、（11.6±0.4）%、（21.78±1.2）%、（31.8±4.8）%、（42.8±5.4）%、（82.9±6.5）%、（91.2±6.8）%、（96.2±6.4）%、（98.2±7.1）%。與陰性對照組比較，100 ng/mL和300 ng/mL 雷帕霉素組抑制率明顯增加（均P＜0.05）；1 000 ng/mL及以上濃度組抑制率均在80%左右，對細胞抑制率增大更明顯（均P＜ 0.05）。可見，雷帕霉素呈濃度依賴方式抑制細胞的增殖。

將MTT獲得的數據（0～1 000 ng/mL）代入到改良的窛式法公式中，求得IC50=495.800 ng/mL。

3 討論

鼻息肉是常見的慢性鼻黏膜炎癥疾病，發病率較高，易復發，嚴重影響患者的日常生活質量。近年來研究［8-9］表明，鼻息肉組織中有大量的細胞因子、趨化因子和黏附分子的表達，這些化學因子介導炎癥細胞的趨化、聚積、活化和抗凋亡過程，直接導致疾病的發生。鼻息肉的病理學改變包括上皮細胞增殖、嗜酸性粒細胞浸潤、細胞外基質增加、血管通透性增加。上皮細胞增殖的增強在鼻息肉的發病過程中起重要作用，并與炎癥有關［10］。由炎癥介質引起的上皮細胞的損傷可通過上皮細胞的修復而被誘導增殖［11］。息肉最初形成時基底膜及覆蓋的上皮層局部破裂，隨后固有層的炎癥結締組織經上皮缺損處膨出，然后該處周圍邊緣的上皮細胞分化使膨出的組織再上皮化，這一黏膜的再生過程導致息肉黏膜突起。組織水腫是血管通透性增高的結果。鼻息肉的病理改變提示研究鼻息肉形成機制的切入點可在誘導鼻腔黏膜發生改變的因素中尋找。

mTOR可磷酸化 p70S6K和 4E-BP1，促進蛋白質合成。mTOR的活性受氨基酸尤其是亮氨酸濃度的調節，生長因子及能量水平也能通過 AMPK 調節mTOR活性。PI3K/Akt和Akt/TSC1-TSC2兩條信號通路都可調控 mTOR 活性，進而調節細胞的生長與增殖［12］。在PI3K/ Akt/ mTOR信號通路中，PI3K可被激活的Ras通路以及一些生長因子及細胞因子（胰島素樣生長因子、表皮生長因子、血小板源性生長因子、集落刺激因子等［13］）激活。活化的PI3K使Akt的308位的Thr磷酸化，在PDK-2的存在下，其473位的Ser再被磷酸化從而使Akt完全激活。Akt活化后可磷酸化TSC-2的Ser939和Thr1462，抑制了TSC-1/ TSC-2復合物的形成，從而解除了對Rheb的抑制作用，使mTOR激活。有研究［6］證明鼻息肉組織中PI3K、Akt和mTOR表達均上調，三者有協同表達關系，提示可能是通過PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路使炎癥細胞凋亡受到抑制，導致慢性炎癥反應，最終形成鼻息肉。

雷帕霉素在細胞外的受體為 FK506結合蛋白FKBP-12。近年來，雷帕霉素在臟器移植術后［14］、腫瘤治療［15］及預防冠狀動脈支架成形術后再狹窄［16］等方面的作用得到了廣泛研究，并且已成功應用于臨床。本研究結果顯示，原代培養方法培養的鼻息肉細胞生長良好，大量鋪路石樣細胞經鑒定為鼻息肉黏膜上皮細胞，少量梭形細胞可能為成纖維細胞。與陰性對照組比較，100 ng/mL和300 ng/mL 雷帕霉素組抑制率明顯增加（P＜ 0.05）；1 000 ng/mL及以上濃度組抑制率均在80%左右，對細胞抑制率增大更明顯（均P＜ 0.05）。可見，雷帕霉素呈濃度依賴方式抑制細胞的增殖。MTT實驗中細胞抑制率達80%時，增大藥物濃度后細胞抑制率不再發生明顯變化，可能是因為原代培養的鼻息肉細胞中大部分細胞為黏膜上皮細胞，雷帕霉素抑制的細胞可能為此部分細胞。剩余未被抑制的細胞可能為少部分鼻息肉中的成纖維細胞及其他種類細胞。提示雷帕霉素可能對鼻息肉黏膜細胞作用較為顯著，但具體作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，雷帕霉素可以抑制鼻息肉細胞的增殖。并且隨藥物濃度增大，對細胞增殖的抑制力明顯增強。認為mTOR信號通路在鼻息肉的發生發展中可能起一定的作用。本實驗中因取材的部位不同，處理時間不同等因素可能導致原代培養的細胞成分組成差異較大，因此可能對雷帕霉素抑制鼻息肉細胞增殖的作用有一定影響。