響應面優化紫蘇葉中黃酮類物質提取工藝研究

李曉雪 王菲 崔新爽 楊逢建

摘?要：為研究紫蘇葉中黃酮類物質的最佳工藝條件，本研究以黃酮類物質提取率為評價指標，采用微波輔助提取法從紫蘇葉中對其進行提取。在此基礎上，應用響應面Box-Benhnken優化技術對紫蘇葉中黃酮類物質的微波提取工藝加以完善。得出最佳工藝條件為：微波時間30 min、微波功率268 W、液料比15∶1 ml/g、乙醇體積分數80%，實際提取率高達7.833%，與理論推測值7.849%±0.016%，為開發紫蘇葉中黃酮類物質提供支撐材料和理論依據。

關鍵詞：紫蘇葉;黃酮;微波輔助;響應面優化;最佳工藝條件

中圖分類號：Q946文獻標識碼：A文章編號：1006-8023（2019）06-0048-07

Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Perilla Leaves

by Response Surface Methodology

LI Xiaoxue， WANG Fei， CUI Xinshuang， YANG Fengjian*

（Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， Northeast Forestry University， Harbin 150040）

Abstract：In order to study the optimal technological conditions of flavonoids in the leaves of perilla， this study took the extraction rate of flavonoids as the evaluation index， and used microwave-assisted extraction method to extract flavonoids from the leaves of Perilla. On this basis， the microwave extraction process of flavonoids was improved by response surface Box-Benhnken optimization technology. The optimum conditions were as follows： microwave time was 30 min， microwave power was 268 W， liquid-material ratio was 15∶1 ml/g， volume fraction of ethanol was 80 %， actual extraction rate was as high as 7.833 % and deviation from theoretical value was 7.849 % ± 0.016 %. It provided support materials and theoretical basis for the development of flavonoids in perilla leaves.

Keywords：Perilla leaves; flavonoids; microwave assisted; response surface optimization; optimal process conditions

0?引言

紫蘇（Perilla frutescens（ L.） Britt. ），又稱白蘇，唇形科紫蘇屬，一年生草本植物[1-3]，具有特異芳香氣味[4]。紫蘇葉中的營養成分極其豐富，包括水、蛋白質、碳水化合物、脂肪以及多種維生素等。不僅如此，紫蘇葉中還有紫蘇醇、紫蘇酮、薄荷醇、薄荷酮、丁香油酚及白蘇烯酮等物質[5-8]。其中的黃酮類物質是植物中主要的多酚類天然產物， 是天然酚性化合物之首。其主要藥理作用為抗肝臟毒性、抗菌、抗氧化、降血脂、抗衰老、抗疲勞和增強免疫功能等[9-11]。

黃酮類物質的提取方法有很多，其中，微波輔助提取技術是借助微波過程中紅外熱導作用，具有較好的受熱條件及穿透性，在植物活性物質分離和純化的過程中得以廣泛的應用[12]。因此，本研究對紫蘇葉中黃酮類物質的微波輔助提取進行了系統性的研究與分析，通過單因素試驗和響應面優化對紫蘇葉黃酮類物質的最佳提取方法和工藝條件予以分析、確定，為開發紫蘇葉總黃酮類化合物提供支撐材料和理論依據[13]。

1?材料與儀器

1.1?材料與試劑

紫蘇葉于2018年9月末采自黑龍江地區。蘆丁標準品（上海源葉生物科技有限公司）、無水乙醇（天津市致遠化學試劑有限公司）、氫氧化鈉（天津市恒興化學試劑制造有限公司）、硝酸鋁（天津市凱通化學試劑有限公司）、亞硝酸鈉（天津市凱通化學試劑有限公司）等試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.2?設備與儀器

試驗儀器：磁力攪拌水浴鍋（常州恩培儀器制造有限公司）、微波爐（佛山市順德區格蘭仕微波爐電器公司）、KQ-500DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、752N型紫外分光光度計（上海精科實業有限公司）、旋轉薄膜蒸發器（上海一科儀器有限公司）。

2?實驗方法

2.1?紫蘇總黃酮含量測定

2.1.1?標準曲線繪制

5 mg蘆丁標準品，溶于5 ml甲醇，配置濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/ml的標準溶液，蒸餾水為空白樣品。取0.5 ml標準溶液置于比色管中，加入0.5 ml 5%亞硝酸鈉、0.5 ml 10%硝酸鋁、4.0 ml 4%氫氧化鈉和4.5 ml 95%無水乙醇，混勻避光靜止15 min，在510 nm波長下測定吸光值[14]。以蘆丁標準品的質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線[15]，所得曲線如圖1所示。

對蘆丁標準曲線圖1中所有數據進行回歸分析，所得的線性方程y=0.621 1x+0.005 6， R2=0.999 3。

2.1.2?總黃酮含量的測定

將樣品用蒸餾水溶解，稀釋50倍后，按照上述方法測定OD值（吸光度）。之后，通過蘆丁標準曲線來計算樣品的總黃酮含量，計算公式：

y=c×vm×100%。

式中： y代表總黃酮含量，%;c代表樣品濃度，g/ml;v代表樣品液體總體積，ml;m代表樣品質量，mg[16]。

2.1.3?數據統計與處理

單因素試驗數據采用Excel2010進行繪制處理，響應面試驗結果用Design Expert 8.0.6軟件分析。

2.2?單因素試驗

2.2.1?乙醇體積分數對紫蘇葉中黃酮類物質提取率的影響

每組稱取紫蘇葉5 g，微波功率為230 W，液料比為15∶1 ml/g，微波時間30 min，在乙醇體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%下進行提取，研究不同乙醇體積分數對紫蘇葉中黃酮類物質提取率的影響。

2.2.2?液料比對紫蘇葉中黃酮類物質提取率的影響

稱取紫蘇葉5 g，微波功率為230 W，選取80%的無水乙醇，時間30 min，分別在液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 ml/g 5種情況下進行提取，探究不同液料比對試驗結果的影響。

2.2.3?微波時間對紫蘇葉中黃酮類物質提取率的影響

稱取5 g干燥的紫蘇葉，將其按15∶1 ml/g的液料比溶入80%的無水乙醇中，在微波功率為230 W下分別提取10、20、25、30、35 min，考察不同提取時間對紫蘇葉中黃酮類物質提取率的影響。

2.2.4?微波功率對紫蘇葉中黃酮類物質提取率的影響

稱取5 g干燥的紫蘇葉，80%的無水乙醇，將其按15∶1 ml/g的液料比混合，在微波功率分別為120、230、385、540、700 W下提取30 min，探究不同微波功率對紫蘇葉中黃酮類物質提取率的影響。

2.3?響應面試驗因素與水平的選取

為了更進一步研究微波輔助提取法提取紫蘇葉中黃酮物質過程中諸多因素之間的關系，根據以上單因素試驗結果，應用Box-Behnken試驗設計原理選取微波功率、微波時間和液料比3個影響程度較高的因素，在響應面分析方法下進行試驗工藝參數的優化，最大程度地對黃酮類物質進行提取。并且對三個因素的影響程度進行了橫向對比。其中試驗因素與水平表見表1。

3?結果與討論

3.1單因素試驗結果

3.1.1?乙醇體積分數

黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增加逐漸發生變化，呈現出先增加后降低的趨勢[17]，在乙醇體積分數為80%時提取率達到最高（圖2）。試驗發現，水分子為主要的升溫來源，當乙醇體積分數為70%～80%時，水含量較高，增大了溶液對物料的滲透性，從而提高了黃酮類物質的提取率。但隨著乙醇比例的增大，水分子逐漸減小，對物料的升溫速度產生了影響，阻礙黃酮類物質的溶出，從而影響提取率。故選用70%～90%的無水乙醇進行優化試驗。

3.1.2?微波時間

隨著提取時間的延長，黃酮提取率也在逐漸上升，在30 min時提取率最高，隨后又呈現下降的趨勢（圖3）。其原因可能是由于隨著時間的延長，黃酮類物質不斷地從紫蘇葉中溶出，在30 min時幾乎全部溶出;但由于長時間的微波輻射，使一些熱不穩定的黃酮變性損失，或者導致溶劑有所揮發，從而使提取率下降。因此，選用25～35 min的微波提取時間進行優化試驗。

3.1.3?微波功率

隨著微波功率的增大，黃酮提取率不斷升高，但上升速度趨于緩慢（圖4）。可能是因為在微波輻射的過程中，溶質吸收微波的能力逐漸增強[18]，在微波功率230 W時達到飽和點，黃酮的提取率最大。但隨著功率的不斷上升，黃酮類物質的損失程度也在不斷加大。綜合考慮，選擇120～385 W的微波功率進行優化試驗。

3.1.4?液料比

隨著液料比的增大，黃酮類物質的提取率逐漸升高（圖5）。這表明在溶質一定的情況下，加入的乙醇比例越多，黃酮提取率越高。這可能是因為濃度差加大利于黃酮類物質從原料中溶出，在15∶1 ml/g的比例下黃酮類物質全部融出;在臨界點（15∶1 ml/g）之后，試驗產生的雜質一并隨著液料比的升高而增大，從而影響黃酮的提取率。綜合考慮，應選取10∶1～20∶1 ml/g進行優化試驗。

3.2?響應面試驗優化結果

3.2.1?響應模型的建立與顯著性檢驗

設計方案與結果見表2。其主要目的是用來分析試驗誤差，以黃酮得率（R）為響應值進行回歸擬合，最終得到二次多元回歸方程模型：

R=+7.82+0.025A+0.14B-0.038C-0.10A·B+

0.000A·C+0.025B·C-0.22A2-0.40B2-0.20C2

由方差分析結果（表3）可知，所得出的回歸方程中不同變量與響應值之間影響的顯著程度是由由F值的大小決定的，即F值越大，影響程度越強;相反F值越小，影響程度越弱。因此，在應用微波輔助提取法提取黃酮類物質的過程中各個因素對黃酮提取率的影響程度依次為：B-功率>C-料液比>A-時間。P>0.05差異性不顯著，P<0.01差異性極顯著。其中總模型方程P模型=0.0002<0.05表現為顯著，不同處理條件之間的差異極顯著;P失擬=0.541 3>0.05說明差異之間不顯著。標準方差反映一個數據集的離散程度，數據整體分布離平均值越近，標準方差就越小（表4）。反之，數據分布離平均值越遠，標準方差越大。模型的精確度與變異系數（CV）有關，CV的值（1.08%）越低精確度越高。系數R2的值為0.967 5>0.9，說明該模型的擬合程度良好。

3.2.2?響應曲面圖和等高線圖分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件擬合出相應的曲面圖和等高線（如圖6～圖8所示），依據黃酮類物質提取率的回歸模型做出響應面圖，可以直觀地反映各因素之間的交互作用對黃酮提取率的影響，并確定最佳提取工藝條件。

3.2.3?優化結果的驗證、對比試驗

通過對響應面數據的分析與單因素試驗進行綜合對比研究，對回歸模型方程進行解析得出黃酮的最佳提取率為7.849%。于此同時微波輔助提取法的最佳工藝參數為：提取時間30 min，微波功率268 W，液料比15∶1 ml/g，乙醇體積分數80%。以優化得出的實驗參數進行3次重復驗證試驗，所得到真實的平均提取值為7.833%，與模型預測值較為相符。通過對表5中兩個數據對比可知，應用微波輔助提取法得到的提取率高于超聲波輔助的得率。同時超聲輔助提取法受有效作用區域的限制，容易在提取物周圍形成超聲空白區;還會造成一定程度的噪音。

4?結論

通過單因素試驗，確定了黃酮類物質的最佳提取方法。在此基礎上采用響應面分析優化法對微波輔助提取紫蘇葉總黃酮的工藝條件進行優化，構建了二次回歸方程模型。通過響應面圖對各因素及其交互作用予以研究和分析，得出微波輔助提取法的最佳提取工藝條件為：時間30 min、微波功率268 W、液料比15∶1 ml/g、乙醇體積分數80%，為紫蘇葉的精深加工利用以及提高其附加值提供了理論的依據。

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