鹽酸氯吡格雷中基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法學(xué)研究

王敏

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 301700

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀，VWD檢測(cè)器。

1.2 試藥

對(duì)甲苯磺酸甲酯對(duì)照品，純度98%；對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品，純度98%。上述對(duì)照品均為SIGMA-ALDRICH。色譜甲醇、色譜乙腈均為Fisher公司，試驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACE 3C18柱（150×4.0mm，3μm）；流動(dòng)相以0.02mol/L磷酸氫二鉀（磷酸調(diào)節(jié)PH至6.5）-乙腈=7:3為流動(dòng)相A，乙腈：甲醇=2:1為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～42min，100%A；42～45min，A100% → 29%；45～55min，29%A；55～75min，100%A）流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)225nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量100μl。空白溶劑為50%乙腈溶液。

2.2 溶液的制備

對(duì)照溶液的制備：精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供試品溶液的制備：精密稱取樣品適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含鹽酸氯吡格雷30mg的溶液。

2.3 檢測(cè)靈敏度

檢測(cè)限：精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各60mg同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液42μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對(duì)甲苯磺酸甲酯的檢測(cè)限溶液；取儲(chǔ)備液83μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對(duì)甲苯磺酸乙酯的檢測(cè)限溶液。分別精密量取上述檢測(cè)限溶液各100μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，色譜圖主峰峰高約為基線噪音的3倍。

結(jié)果表明，當(dāng)供試品濃度為30mg/ml時(shí)（折算成進(jìn)樣量為3mg），是對(duì)甲苯磺酸甲酯最低檢測(cè)濃度的約600萬(wàn)倍，是對(duì)甲苯磺酸乙酯最低檢測(cè)濃度的約280萬(wàn)倍，因此供試品中大于0.0002‰的雜質(zhì)可被有效檢出，完全可以滿足檢測(cè)靈敏度的要求[1]。

定量限：取檢測(cè)限項(xiàng)下儲(chǔ)備液167μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對(duì)甲苯磺酸甲酯的定量限溶液；取檢測(cè)限項(xiàng)下儲(chǔ)備液250μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對(duì)甲苯磺酸乙酯的定量限溶液。

分別精密量取上述定量限溶液各100μl注入液相色譜儀，色譜圖主峰峰高約為基線噪音的10倍，對(duì)甲苯磺酸甲酯定量限為2.0ng，相當(dāng)于樣品量0.0007‰；對(duì)甲苯磺酸乙酯定量限為3.2ng，相當(dāng)于樣品量0.001‰。

精密量取上述定量限溶液各100μl，連續(xù)6次進(jìn)樣，作為定量限精密度溶液，記錄色譜圖，考察連續(xù)進(jìn)樣各次的樣品峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示連續(xù)6針對(duì)甲苯磺酸甲酯峰面積RSD為5.2%，對(duì)甲苯磺酸乙酯峰面積RSD為3.5%，定量限精密度良好。

2.4 線性

精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液 250μl、335μl、400μl、500μl、600μl、750μl、1ml分 別 置 5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，制成一系列的線性溶液。取上述溶液各100μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求出線性方程和相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)甲苯磺酸甲酯濃度在0.03μg/ml～0.12μg/ml之間，線性方程y=337.8x+1.1484，R2=0.9994，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。對(duì)甲苯磺酸乙酯濃度在0.03μg/ml～0.13μg/ml之間，線性方程y=346.75x-1.1931，R2=0.9994，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.5 系統(tǒng)適用性/重復(fù)性

精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，再取1ml置10ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，制成系統(tǒng)適用性溶液。取上述溶液100μl連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察連續(xù)進(jìn)樣各次的樣品峰面積，計(jì)算RSD。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)6次進(jìn)樣結(jié)果表明對(duì)甲苯磺酸甲酯6針?lè)迕娣eRSD為2.1%、對(duì)甲苯磺酸乙酯6針?lè)迕娣eRSD為2.3%，說(shuō)明該方法系統(tǒng)適用性良好，且方法的重復(fù)性良好。

2.6 回收率

取鹽酸氯吡格雷及對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品，均按限度濃度的80%、100%和120%進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，每個(gè)濃度配制3份樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)甲苯磺酸甲酯的加樣回收率在84～96%之間，平均回收率為 90.5%，RSD=3.7%，對(duì)甲苯磺酸乙酯的加樣回收率在96～113%之間，平均回收率為104.7%，RSD=5.8%，回收率較好。

2.7 耐用性

分別考察了不同柱溫、不同檢測(cè)波長(zhǎng)、不同流速、不同流動(dòng)相PH對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果如下：

正常條件：采用C18柱（150×4.0mm），以0.02mol/L磷酸氫二鉀（磷酸調(diào)節(jié)PH至6.5）-乙腈=7:3為流動(dòng)相A，乙腈：甲醇=2:1為流動(dòng)相B，檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm，柱溫30℃，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量100μl，采用梯度洗脫。空白溶劑：50%乙腈溶液。對(duì)照溶液的制備：精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供試品溶液的制備：精密稱取樣品適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含鹽酸氯吡格雷30mg的溶液[2]。

不同檢測(cè)波長(zhǎng)：將檢測(cè)波長(zhǎng)變更為220nm和230nm，其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明檢測(cè)波長(zhǎng)改變后，檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯變化，方法耐用性良好。

不同柱溫：將柱溫變更為25℃和35℃，其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柱溫改變后，對(duì)甲苯磺酸甲酯及對(duì)甲苯磺酸乙酯的出峰時(shí)間有所變化，但對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響，方法耐用性較好。

不同流速：將流速變更為0.9ml/min和1.1ml/min，其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明流速改變后，對(duì)甲苯磺酸甲酯及對(duì)甲苯磺酸乙酯的出峰時(shí)間有所變化，但對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響，方法耐用性較好[3]。

不同流動(dòng)相PH值：將流動(dòng)相A的0.02mol/L磷酸氫二鉀分別用磷酸調(diào)節(jié)PH至6.4和6.6在與乙腈按7:3混合，其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明流動(dòng)相PH改變后，對(duì)甲苯磺酸甲酯及對(duì)甲苯磺酸乙酯的出峰時(shí)間有所變化，但對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響，方法耐用性較好。

3 結(jié)語(yǔ)

基因毒性物質(zhì)是指能直接或間接損害DNA，導(dǎo)致基因突變或癌癥的物質(zhì)。基因毒性物質(zhì)對(duì)DNA的損害作用包括染色體斷裂、DNA重組、DNA復(fù)制過(guò)程中共價(jià)鍵結(jié)合或插入，也包括通過(guò)激活細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)而產(chǎn)生的突變。近年來(lái)有關(guān)藥物中的基因毒性雜質(zhì)的控制得到來(lái)自于藥物監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)的高度重視，基于風(fēng)險(xiǎn)管理的階段化TTC控制策略，使得基因毒性雜質(zhì)的控制更趨科學(xué)合理。TTC概念的應(yīng)用允許在無(wú)任何體內(nèi)數(shù)據(jù)時(shí)，在足夠的安全性基礎(chǔ)上建立雜質(zhì)控制限度。TTC概念的應(yīng)用有利于患者、企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)，使他們避免做不必要的毒理研究和安全性評(píng)估。歐洲藥典委員會(huì)認(rèn)為一個(gè)產(chǎn)品在接受市場(chǎng)監(jiān)管的時(shí)候，應(yīng)該對(duì)可能存在的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估，這是建立一個(gè)新產(chǎn)品各論的基本要求。磺酸酯作為一類較為常見(jiàn)的基因毒性雜質(zhì)，可以通過(guò)對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化與設(shè)計(jì)進(jìn)行有效控制，符合當(dāng)下“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念，即良好的工藝設(shè)計(jì)往往能促進(jìn)高質(zhì)量藥物的生產(chǎn)，并在充分保障藥物安全性的基礎(chǔ)上盡可能減少企業(yè)的研發(fā)投入及相應(yīng)的政府監(jiān)管成本。