污水地下滲濾系統微生物代謝組學分析

楊 蕾,李英華,李海波,蘇 菲

污水地下滲濾系統微生物代謝組學分析

楊 蕾,李英華*,李海波,蘇 菲

(東北大學資源與土木工程學院,遼寧 沈陽 110000)

應用超高效液相色譜-質譜技術(UPLC-MS),基于代謝組學方法,篩選不同進水有機負荷下地下滲濾系統潛在生物標志物.采用偏最小二乘法(PLS-DA)和主成分分析(PCA)模式識別方法對樣品進行分型處理,根據模型的變量重要性因子(VIP值)篩選潛在生物標志物,分析代謝產物蘊含的生物學信息,研究代謝通路,通過RDA分析探索代謝產物與環境因子之間的相關性.PLS-DA模型結果表明,當進水有機負荷為250mg/L、400mg/L、500mg/L時,同一高度層代謝產物間存在顯著性差異,共篩選出VIP值大于1.5的230種差異代謝物,以有機酸為主;同時也存在一些醇類、酚類等微生物代謝中間產物.此外,微生物代謝產物與模擬土柱高度有顯著對應性.在水力負荷為0.14m3/(m2·d),COD污染負荷為400mg/L條件下,3個高度層H2(500mm)、H4(1000mm)、H6(1500mm)篩選出53種VIP值大于1.5的差異代謝物,以酸類、酮類物質為主.RDA分析表明,隨著有機負荷波動和剖面高度的變化,代謝產物受到氧化還原環境(ORP)與硝態氮(NO3-)的影響較大,呈負相關.

地下滲濾系統；代謝組學；微生物；潛在生物標志物

污水地下滲濾系統(SWIS)是一種由非均勻介質組成多相共存的污水生態處理技術,具有運行費用低,處理效果好,維護管理簡單,生態效益明顯等優點[1],其理論研究和工程應用受到廣泛關注.

近年來,傳統平板法、變性梯度凝膠電泳(PCR- DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)等傳統生物技術被廣泛應用于SWIS微生物種群結構分析.通常認為利用微生物的時空協調性指示SWIS是否健康更具說服力,通過精準診斷微生物結構和豐度來判定微生物協作關系,一直被學界廣為接受[2].然而,微生物空間分布雖然能夠反映一段時間內基質層的菌群協作狀態,但當系統因擾動偏離健康軌跡時,微生物群落并不能快速做出調整,反饋在出水上即不會立刻出現水質惡化的現象[3].因此,利用DNA分子標記、基因序列分析與核酸分子雜交等方法研究SWIS菌群結構變化僅對穩態系統有意義,對多因素擾動的系統,所獲得的生物學信息僅能標定相對狹窄的時段,用以表征系統健康度,必要但不充分[4].例如,通過對水力負荷波動條件下SWIS多剖面PCR-DEEG分析,發現在低水力負荷(8cm/d)狀態下獲取的微生物空間結構數據僅能指示不超過24h的種群特征,當水力負荷在±2cm/d范圍內波動時,同一層DNA數據變化較大[5-6].即使進一步采用DNA指紋和Real-time熒光定量技術分析,也只是在穩態下才能獲得ANO、qnorB等優勢硝化基因群落富集于上升流區, amoA、narG等優勢反硝化基因群落富集于重力流區的結論.而當擾動發生時(即使不劇烈),同樣發現同一流區基因空間分布相對紊亂(上升流區出現amoA)[7].因此,以往研究表明,利用微生物結構-水質的響應關系表征SWIS健康度在理論上存在缺陷.

高通量測序具有高準確性、高通量、高靈敏度、低運行成本等突出優勢,可以同時完成傳統基因組學研究以及功能基因組學研究.高通量測序技術基于轉錄組分析,可以從大量轉錄組信息中發掘差異基因,快速判斷核心調控網絡和關鍵候選基因,促進轉錄因子功能的進一步分析.但由于基因的補償作用,某個基因的缺失會使得其他基因的存在而得到補償,最后的反應凈結果為零,基因組的變化不一定能夠得到表達.而代謝組學可對生物體內所有代謝產物進行定性和定量分析,小分子的產生和代謝能夠準確反映生物體系的狀態.

微生物代謝組學是一種理解細胞功能至關重要的功能基因組學的技術,是對細胞生理狀態的直接反映,也可較為詳細地反映土壤微生物多樣性[8].微生物代謝組學能夠逆向推理微生物的代謝途徑及代謝方式,在微生物種類極其繁多的現實條件下,利用該方法對微生物代謝途徑進行研究,具有精準性和靶向性優勢.本研究利用微生物代謝組學的宏觀性,通過超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)分析技術對代謝產物進行數據采集,經預處理、統計分析、生物學解釋獲得大量數據,表達為特定的代謝指紋圖譜,篩選潛在生物標志物[9];探究代謝產物蘊含的生物學信息,研究其代謝通路,分析代謝產物與環境因子的相關性.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗采用如圖1所示的模擬裝置1#、2#、3#進行研究.裝置主體尺寸為180cm×30cm(高×直徑).所填充的基質從下往上依次為5cm 厚的礫石、3cm厚的細砂、以及140cm厚的混合基質.混合基質由沙、爐渣和農田土按體積比10%:25%:65%混合而成,孔隙度0.55,滲透系數范圍為4.167×10-5~1.389× 10-3cm/s.由蠕動泵泵送進水,并通過“十字”型穿孔布水管(表層土壤下65cm處)散水.每套設置沿縱向剖面設6組土壤取樣口(從上至下依次編號為H1、H2、H3、H4、H5、H6),平時密封,只有采樣時短暫開啟.各取樣口距離裝置底部的距離及取樣口編號如表1所示.

圖1 SWIS模擬裝置

表1 地下滲濾系統取樣口編號、高度及分區

1.2 試驗過程

以葡萄糖(C6H12O6)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、亞硝酸鈉(NaNO2)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)按照所需比例配制成生活污水,在水力負荷為0.14m3/(m2·d)的條件下,控制有機污染負荷為250mg/L、400mg/L、500mg/L,干濕交替運行,控制布水期(12h)和落干期(12h)時間.根據前期研究結論,SWIS氧化還原電位(ORP)大于300mV時可認為是好氧環境,小于300mV時則為缺氧或厭氧環境,小于-200mV為完全厭氧環境[10].經連續監測,H1(300mm)、H2(500mm)處氧化還原電位ORP均值分別為300mV,450mV;H3(750mm)、H4(1000mm)處分別為150mV,50mV;H5(1250mm)、H6(1500mm)處ORP值均低于-380mV.因此,隨著進水-落干的交替運行,H1、H2高度以上區域為好氧環境,H3、H4區域環境則缺氧-厭氧變化,H5、H6區域始終處于厭氧環境[11].因此為了減少樣品分析工作量,待系統穩定運行后,分別從H2、H4、H6高度的土壤取樣口取5g土壤于5mL離心管中,每一高度取樣口所取土壤均制成2個平行樣,樣品處理完后將所有樣本立即置于-80℃冰箱中保存.同時,采集出水水樣并測定常規的理化指標.

1.3 樣品預處理

將采集到的土壤樣品,迅速用液氮滅活,用純甲醇提取劑進行溶液提取,提取液體積10mL,提取3次,合并提取液,真空旋干,用1mL甲醇復溶,13000r/min離心機離心10min,吸取上清,裝入1.5mL進樣小瓶,放置于4℃冰箱,待上機檢測.

1.4 試驗條件

土壤樣品測定采用美國安捷倫公司生產1260Infinity-6420液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀.測定條件為:流動相由A相(甲酸:水=0.1:100)和B相(乙腈)組成,流速0.2mL/min,柱溫30℃.梯度洗脫條件為:0min,15%B;10min,65%B;15min,80%B; 30min, 95%B;38min,99%B;55min,99%B;56min,15%B;69min, 15%B;質譜采用ESI離子源,在正離子模式下采集數據,離子采集范圍是50~1800m/z.

1.5 數據處理

采用UPLC-MS全掃描方式分析微生物代謝產物,將得到的數據文件以簡單模式進行AMDIS分析,進而對代謝產物的總離子流圖進行色譜峰識別與峰匹配,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)模式識別對操作條件進行差異判別分析.

2 結果與討論

2.1 SWIS代謝組學檢測方法

表2 檢測到的部分化合物

2.1.2 數據采集 由于土壤微生物代謝產物成分較復雜,大多數化合物為堿性化合物,TIC在ESI+模式下的響應比較好,大部分代謝產物能夠在此模式下出峰[14].且正離子模式下,檢測到的峰譜較集中,檢測時間較短.對于SWIS代謝產物的檢測,適合在質譜正離子模式(ESI+)下分析.圖2是SWIS土壤樣品經UPLC-MS分析得到的典型代謝指紋圖譜.

圖2 正離子模式識別色譜

2.1.3 數據預處理 應用一系列的化學計量學方法將色譜質譜中的波譜信號為數據信息[15],包括:去除奇異點,濾除噪音,峰識別,重疊峰分析,峰對齊,峰匹配,標準化和歸一化等.

2.1.4 統計分析 經過預處理后的數據進行多變量統計分析,多元統計量的主要手段是模式識別技術.模式識別可分為非監督有監督方法[16],非監督方法中主成分分析(PCA)和監督方法中偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)是代謝組學研究中最常用的模式識別方法,這兩種方法通常以得分圖獲得對樣品分類的信息,載荷圖對分類有貢獻變量及其貢獻大小,從而用于篩選生物標志物.

2.2 不同有機負荷下生物標志物的篩選

圖3 不同有機負荷波動下PCA

橫縱軸代表兩個能最大程度反映方差的兩個特征值,圖中每個點代表一個樣本,形狀則代表不同柱子分組,即圓圈代表柱1樣本、方框代表柱2樣本、三角形代表柱3樣本(下同);越相似的樣本在圖中的距離越近,反之距離越遠的樣本差異越大;圈外的點代表離散點,誤差較大

根據模式識別模型的VIP值篩選潛在標志物.通過分析不同樣品的組成可以反映樣品間的差異和距離,PCA運用方差分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上,坐標軸為能夠最大程度反映方差的兩個特征值[17].如圖3所示,圖中每一個顏色代表一個模擬柱,即樣本點分組,相同分組的點以橢圓標出,可以看出樣本組與組之間存在一定的距離,這說明樣本組之間的距離越大,對應的代謝產物差異越大;而圖中樣本點接近或重合的部分,則表示微生物代謝產物差異不明顯.這說明在無監督模式識別情況下,有機負荷為250mg/L、400mg/L、500mg/L的3個模擬柱之間微生物代謝產物存在差異.

從PCA模型看出,3組地下滲濾系統模擬柱微生物代謝產物之間雖存在差異,但不明顯,模型只解釋了45%的原始數據,需要采用更加適合的模型來表征代謝指紋.PLS-DA是以偏最小二乘法回歸模型為基礎,作為一種有監督的模式識別的方法,根據給定的樣本分組信息,對群落結構進行判別分析[18].從PCA圖中可以看到樣本的原始狀態,而PLS-DA看到的是樣本的分組效果.通過PLS-DA模型圖找到造成組間差異的物質.為此,采用PLS-DA方法來區分3個模擬柱微生物代謝產物差異,篩選潛在標志物.PLS-DA在PCA分析的基礎上,使得組分之間的區分效果更明顯,具有導向性.

圖4 不同有機負荷波動下PLS-DA

形狀相同的點屬于同一分組,如果屬于同一分組的樣本之間的距離越近,同時不同分組的樣本之間的距離越遠,說明分類模型效果越好

如圖4所示,屬于同一橢圓內的樣本之間某種程度上聚合,不同分組的樣本之間的距離區分比較明顯,這充分說明不同有機負荷的微生物代謝產物之間存在差異.實驗模擬柱中的裝填基質土和取樣時間點相同,而3個模擬柱有機負荷進水濃度逐漸增加,這說明進水濃度與模擬柱之間的微生物代謝產物差異存在相關性.

在污水地下滲濾系統中,營養物質是影響微生物生長分布的主要因素之一,有機物的降解主要依靠土壤等基質過濾吸附和微生物作用,污水與基質不斷接觸的過程中,污水中大部分有機物被土壤膠體物質吸附,繼而在微生物氧化作用下分解去除[19].不同有機負荷的進水條件為微生物的生長提供必要的營養物質,有機負荷不同,相對應的微生物結構及代謝途徑存在差異,進而微生物代謝產物之間存在顯著性差異.

2.2.1 潛在標志物識別 經過PLS-DA分析得到所有磷脂分子的變量投影重要值(VIP值)排列圖,代謝差異化合物篩選的一般原則是在兩組(分批過程和連續過程組)PLS模型中的VIP值大于1[20].通過模擬柱不同有機負荷的PLD分析,找到VIP 值大于1的有500多個化合物,VIP大于1.5的化合物有230個.在此挑選具有代表性的差異物,選取1.5作為篩選的臨界值.VIP值從0~2之間波動,VIP值大于2的潛在標志物約為8.4%,1.5

表3 不同有機負荷條件下的潛在標志物

注:1)Var ID代表一個物質;2)以序列號為例,1253.8s代表處理時間,292.23代表化合物的分子量, 2.93324代表VIP值.

表4 有機負荷波動下SWIS生物代謝產物定性分析

2.2.2 代謝途徑分析 基于上述理論,將推定的鑒定化合物提交KEGG途徑數據庫.代謝通路圖可以直觀的展示產物代謝過程中的相互作用,可以表現受體結合的活動,蛋白質復合物,磷酸化反應,酶的活化等,將通路與生物學注釋連接在一起,使得產物的代謝途徑更加清晰.

圖5為Gingerglycolipid C 結構示意圖.糖脂是糖通過半縮醛羥基以糖苷鍵與脂類連接的化合物.由于脂類部分不同,糖脂可分為鞘糖脂、甘油糖脂和類固醇衍生糖脂.根據化合物結構,Gingerglycolipid C屬于鞘糖脂,是細胞膜脂的主要成分.鞘糖脂分子中神經酰胺羥基被甲基取代.脂類代謝產生長鏈脂肪酸,長鏈脂肪酸首先被轉化成脂酰輔酶CoA,經輔酶AveA、AveE、AveF催化,在脂肪酸氧化酶作用下脫氫,脫下的氫和O2結合成H2O2,進一步反應釋出較短鏈脂肪酸,生成“B1b”.圖6為Gingerglycolipid C代謝通路圖.通過Gingerglycolipid C代謝通路圖,可以逆推Gingerglycolipid C是脂類物質代謝產物,而分解代謝的初步階段是將蛋白質、多糖以及脂類等大分子物質降為氨基酸、單糖及脂肪酸等小分子物質,這充分說明Gingerglycolipid C是微生物的代謝產物.通過已知的代謝通路逆推找出化合物和調節酶,完成微生物代謝機理研究.

圖5 Gingerglycolipid C結構示意

圖6 Gingerglycolipid C代謝通路

2.3 不同高度生物標志物的篩選

在水力負荷為0.14m3/(m2·d),有機污染負荷為400mg/L的條件下,采用PCA分析法對模擬柱高度H2、H4、H6微生物代謝產物進行分析,土壤樣品微生物代謝產物的PCA圖如圖7所示.可以看出,模擬柱相同基質層高度的樣本點距離相近,高度聚合,不同基質層高度樣本代謝產物信息分離比較清晰明顯.這說明模擬柱高度層之間代謝產物存在差異,這與高度層之間的耗氧量存在相關性[21].在SWIS中溶解氧含量是影響微生物生長分布的主要因素之一,土柱H2高度的ORP值為450mV,處于好氧區,區域內以好氧微生物為主;相對而言,土柱中層H4的OPR值為50mV,處于兼性厭氧區;下層H6的ORP值在-380mV波動,氧氣含量逐漸減少,以厭氧微生物為主;土柱中氧氣含量劃分為H2好氧區~ H4兼性厭氧區~H6厭氧區,硝化反應主要發生在滲濾土層的上部好氧區,說明好氧條件刺激了好氧微生物分泌初級代謝產物;反硝化則發生在土層的下部厭氧區,刺激了厭氧微生物分泌了大量特異性代謝產物[22].氧氣含量沿縱向高度發生變化,相對應的代謝產物也發生變化,存在顯著差異,與結果反映的信息一致.

圖7 不同高度微生物代謝產物PCA

橫縱軸代表兩個能最大程度反映方差的兩個特征值,圖中每個點代表一個樣本,形狀則代表不同高度分組,即方框代表高度H2樣本、三角代表高度H4樣本、圓圈代表高度H6樣本(下同).PCA圖中的大橢圓形區域稱作95%置信區間,處于大橢圓圈內的樣本點,具有可信性,處于圈外的樣本點稱作離散點.越相似的樣本在圖中的距離越近,反之距離越遠的樣本差異越大

圖8是有機負荷為400mg/L,不同高度層土壤樣品微生物代謝產物的PLS-DA圖.PLS-DA方法是發現、提取、統計微生物代謝產物差異的有力途徑之一[23].從圖中看出,模擬柱相同高度樣本點聚合,不同高度組分間區分效果明顯,說明同一高度層代謝產物差異較小,不同高度層代謝產物差異較大.表明PLS-DA穩定且具有很好的解釋能力.因此,采用PLS-DA分析對本研究進行結果分析具有可靠性、導向性.適合采用PLS-DA分析進行差異代謝物的篩選.

圖8 不同高度 PLS-DA

每一個點代表一個樣本,每個形狀代表一個高度;如果屬于同一分組的樣本之間的距離越近,同時不同分組的樣本之間的距離越遠,說明分類模型效果越好

2.3.1 潛在標志物識別 潛在生物標志物的識別是代謝組學研究的核心內容和目的之一.本研究以PCA分析為基礎,通過PLS-DA圖對應VIP值(VIP>1的變量表示它對模型分組的貢獻高于平均水平)找到潛在標志物.后期可以通過ANOVA分析(方差分析,t-test,<0.05)識別出不同組別的土壤微生物代謝產物含量有顯著差異的代謝產物,進一步篩選潛在生物標志物[24].SWIS有機負荷為400mg/L,不同高度層土壤樣品微生物代謝產物經PLS-DA分析得到VIP>1.5的代謝產物部分數據,如表5所示.模擬柱高度潛在標準物有53個,VIP>2的有5個化合物.VIP值越大,對模型的分類貢獻越大,可作為篩選差異代謝物的指標之一.采用METLIN代謝組學數據庫對潛在標志物進行分子式推斷、定性,得到部分的化合物如表6所示.

表5 不同高度潛在標志物

表6 不同高度變化下SWIS微生物代謝產物定性分析

2.3.2 代謝途徑分析 代謝途徑作為一種平衡生物合成進程的機能,它主要負責揭示物質的生長過程.研究代謝產物在代謝途徑中的作用已經成為目前的一大熱點.為利于微生物代謝途徑的系統性分析,本研究采用UPLC-MS的方法在生物系統中對特異性代謝物進行鑒定和精確定量.Soraphen A結構圖如圖9所示.經鑒定結果分析,Soraphens是從一種黏細菌Sorangium cellulosum的次級代謝產物中分離得到的一類聚酮類化合物.脂肪酸經?-氧化會產生大量乙酰輔酶,部分輔酶被轉化成酮體.葡萄糖供應充足時,糖分解代謝旺盛,供能充分,脂肪酸氧化分解減少,酮體生成被抑制;葡萄糖供應不足時,脂肪酸氧化分解增加,生成輔酶增加,酮體生成增多. Soraphen A代謝路徑圖如圖10所示,在輔酶SorM和SorB的催化作用下,-CH3被氧化,經脫氫后生成酮體.經過代謝的轉錄和翻譯,機體產生的代謝物可以成為識別代謝途徑異常的關鍵指標.通過顯著性代謝產物分析,探索何種代謝通路在該環境條件下占主導作用,實現SWIS微生物代謝產物對操作參數等響應的定性跟蹤,從而通過代謝物的變化來改變環境干預條件,保持地下滲濾系統的穩定、高效運行.

圖9 Soraphen A 結構示意

圖10 Soraphen A代謝通路

2.4 SWIS差異性代謝產物與環境因子的冗余分析(RDA)

RDA是基于對應分析發展而來的一種排序方法,將對應分析與多元回歸分析相結合,每一步計算均與環境因子進行回歸,又稱多元直接梯度分析. RDA分析是一種排序分析,即在一個可視化的低維空間(二維)重新排列樣本,使得樣本之間的距離最大程度地反映出平面散點圖內樣本之間的關系,直觀的看出樣本分布和環境因子間的關系[25].

圖11 SWIS差異性代謝產物與環境因子的RDA分析

圖中藍色箭頭代表不同的環境因子,紅色箭頭代表不同的代謝產物.環境因子之間的夾角為銳角時,表示兩個環境因子之間正向關,鈍角為負相關.環境因子的射線越長,說明該影響因子的影響程度越大.圖中代謝產物名字均采用英文縮寫表示

從代謝產物與環境因子之間的夾角可以看出(圖11),環境因子NH4+、NO2-與大部分代謝產物呈顯著正相關關系,NO3-、ORP、COD、鹽度與大部分代謝產物呈負相關關系.從環境因子之間的夾角可以看出,NO3-、ORP、COD、鹽度兩兩之間呈正相關;NO2-與NH4+、COD都呈負相關.環境因子射線的長度表明,NO3-和COD對代謝產物影響較大.同時RDA排序圖反映出不同微生物代謝產物對環境因子的適應性不同,即代謝產物在RDA排序圖中的位置越接近,表示其對環境適應性越相似.RDA分析結果表明,在SWIS中,環境因子對微生物代謝產物存在影響,隨著有機負荷波動和不同高度剖面的變化,代謝產物受到ORP與NO3-的影響較大,呈負相關.

3 結論

3.1 本研究通過PLS-DA模型分析了SWIS微生物代謝組學在不同有機負荷、不同剖面的變化,建立了一套基于UPLC- MS技術的SWIS微生物代謝組學研究方法.通過篩選生物標志物,分析了差異性產物的代謝通路,利用RDA分析探索了該代謝產物與主要環境因子(COD,NH4+,ORP等)的相關性.

3.2 在有機負荷波動條件下(COD=250-500mg/L),微生物代謝產物因進水營養物質的不同存在差異性.其中,在中等負荷下(COD=400mg/L),微生物代謝產物與基質層高度顯著相關, 共篩選到53個潛在生物標志物, 定性得到12種化合物,包括:葡萄糖醛酸苷(19-Norandrosterone glucuronide)、戊烯二酸(Glutaconic acid)、杯莧甾酮(cyasterone)等. 同時, ORP與NO3-對微生物代謝產物存在顯著負相關關系.

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YANG Lei, LI Ying-hua*, LI Hai-bo, SU Fei

(School of Resources and Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110000, China)., 2019,39(11)：4812~4822

Based on metabolomics method, ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) was used to screen potential biomarkers of subsurface infiltration systems under different organic loads. The samples were typed by partial least squares (PLS-DA) and principal component analysis (PCA) pattern recognition methods, and potential biomarkers were screened according to the model's variable importance factor (VIP). Furthermore, biological information involved in metabolites and metabolic pathways were revealed. Finally, correlation between metabolites and environmental factors was explored by RDA analysis. The results of PLS-DA model showed that when the influent organic load gradually increased from 250mg/L to 400mg/Land 500mg/L, there was a significant difference between the metabolites in the same soil profile. A total of 230differential metabolites with a VIP value greater than 1.5 were screened out, which were mainly composed of organic acids, such as lactic acid, tartronic acid, dioleoylphosphatidic acid. The microbial metabolites had a significant correspondence with the soil profile. Under the condition of hydraulic load 0.14m3/(m2·d) and COD 400mg/L, 53metabolites with a VIP value greater than 1.5 were screened out from H2 (500mm), H4 (1000mm) and H6 (1500mm), respectively, which was mainly composed of acid and ketone substances, such as 6-Hydroxyondansetron sulfate, 19-Norandrosterone glucuronide and Methylcarbamyl PAF C-8. The results of RDA suggested that with the variation of pollution load and substrate profile, metabolites were negatively influenced by oxidation reduction potential (ORP) and nitrate (NO3-).

subsurface wastewater infiltration system；metabolomics；microorganism；potential biomarke

X523

A

1000-6923(2019)11-4812-11

楊 蕾(1995-),女,遼寧莊河人,東北大學碩士研究生,主要研究方向為污水生態處理技術.發表論文3篇.

2019-04-29

國家自然科學基金資助項目(41571455,51578115)

* 責任作者,教授, liyinghua@mail.neu.edu.cn