高效液相色譜法測定恩拉霉素的含量

郭曉梅 郭雷

山東魯抗舍里樂藥業有限公司 山東濟寧 272100

恩拉霉素（Enramycin）是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子組成的多肽類抗生素，包含恩拉霉素A和恩拉霉素B兩種成分，其對革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，它有利于飼料營養成份的消化吸收，提高飼料利用率，是一種全新的動物專用抗生素促生長劑[1]。

目前，微生物學效價方法測定恩拉霉素含量較為普遍，在《進口獸藥質量標準》中，也是采用的微生物學方法，該方法操作復雜且有一定缺點，而高效液相色譜法由于其快速、準確、操作方便的優點，應用較為廣泛。將HPLC法應用到對恩拉霉素的檢測中，必然會給生產與研發帶來便捷。而HPLC法測定恩拉霉素含量的文獻鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

戴安U-3000高效液相色譜儀和UV檢測器；梅特勒AB104-N型電子天平；FE20型酸度計。

恩拉霉素標準品（含量為968u/mg）、恩拉霉素發酵液、恩拉霉素預混劑均有魯抗舍里樂藥業有限公司提供；

甲醇浸提液：甲醇：2M鹽酸：水=20：1：21（V/V/V）

1.2 色譜條件

島津WondaSil C18（200×4.6mm，5μm，）為測定色譜柱，乙腈：50mM磷酸二氫鈉 3：7（V/V，pH 4.5±0.1）為流動相，267nm的波長，1.0ml/min的流速，柱溫選擇室溫，進樣20μL，運行20min。

1.3 工作標準溶液的制備

取恩拉霉素標準品50mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，用甲醇浸提液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。分別精密量取該液2、4、6、8、10ml置于10ml量瓶中，用甲醇浸提液定容至刻度，搖勻，作為工作標準品溶液，恩拉霉素含量分別為200、400、600、800、1000（ mg/ml）。

1.4 樣品溶液的制備

發酵液樣品處理：取發酵液2ml于一試管中，加18ml甲醇浸提液，搖勻后超聲30分鐘，離心后取上清液過0.45um濾膜（尼龍66）過濾，即得。

4%預混劑樣品處理：精密稱取1.00g 4%預混劑（或閃蒸粉）于 250ml三角瓶中，加入100ml甲醇浸提液，搖勻后超聲半小時，離心10分鐘，上清液用0.45μm濾膜過濾，即得。

2 結果與討論

2.1 線性關系考察

分別將制備好的工作標準品溶液用HPLC測定，以恩拉霉素濃度x（mg/ml）為橫坐標，峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=1695.4x+18095，相關系數R2=0.999。結果表明恩拉霉素在濃度200-1000mg/ml范圍內線性關系良好[2]。

2.2 精密度試驗

在選定的色譜條件下，用恩拉霉素標準品溶液重復進樣5次，峰面積分別為 1702661、1704500、1704890、1704279、1707223，RSD為0.10%，由數據可知其精密度較好。

2.3 穩定性考察

將供試品溶液放置12小時，測定初始值后，每隔兩個小時測定一次，對應峰面積分別為1679528、1679282、1677904、1675449、1677717、1676122、1681359，

RSD為0.10%，說明在12小時內溶液比較穩定。

2.4 加標回收率試驗

精密吸取已知含量的供試品溶液，分別加入一定量的恩拉霉素標準品溶液，用HPLC測定，回收率為99.42%，RSD為2.08%，回收率良好。

2.5 耐用性試驗

（1）改變柱溫：分別改變柱溫為 24.5℃、25.0℃、25.5℃，進樣后記錄主峰峰面積和保留時間，并計算3針峰面積，分別為1755334、1725755、1725514，RSD 為 0.99%， 表 明 在 24.5-25.5℃適用該操作。

（2）改變色譜柱批號：選擇相同品牌，不同序列號（9E9601-03、2A9601-06、2A9601-09）的色譜柱進行驗證，結果表明峰面積RSD為0.41%。

（3）改變流速：按照±10%的變量選擇0.9和1.1mL/min，進樣后記錄主峰峰面積和保留時間，峰面積RSD為0.02%，表明流速在0.9-1.1ml/min范圍適用該操作。

2.6 樣品的含量測定

取恩拉霉素發酵液、恩拉霉素預混劑各3批樣品，按上述方法制備供試品溶液，用高效液相色譜儀檢測，記錄峰面積，按外標法計算預混劑含量，1602003批次為4.02%，1603001批次為3.98%，1603002為4.05%，說明批預混劑含量差異較小，樣品含量測定方法比較穩定[3]。

3 結語

采用高效液相色譜法檢測恩拉霉素發酵液及預混劑中恩拉霉素的含量，實驗所得線性方程為：y=1695.4x+18095，相關系數R2=0.999，線性關系較好，該方法的回收率都95%-105%之間，符合分析要求。通過實驗可知，我們選定的方法操作簡便、準確度高、耐用性好等優點，能有效的檢測發酵液、預混劑中恩拉霉素的含量。