黑龍江省大豆田反枝莧對(duì)氟磺胺草醚的抗藥性機(jī)制研究

滕春紅 王星茗 崔書(shū)芳

摘要 為明確反枝莧抗性種群對(duì)氟磺胺草醚的抗性機(jī)制，分別測(cè)定了氟磺胺草醚對(duì)反枝莧抗性和敏感種群體內(nèi)原卟啉原氧化酶（PPO）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響。結(jié)果表明：氟磺胺草醚處理后，抗性和敏感反枝莧種群PPO活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復(fù)，而敏感種群則不能恢復(fù);施用氟磺胺草醚后，抗性和敏感反枝莧種群GSTs和SOD活性變化無(wú)明顯差異，抗性和敏感反枝莧種群POD和CAT活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復(fù)，而敏感種群則不能恢復(fù)。研究表明，反枝莧抗性種群體內(nèi)PPO對(duì)氟磺胺草醚敏感性降低是其產(chǎn)生抗藥性的原因之一，反枝莧POD和CAT對(duì)活性氧的抵御能力差異也可能與反枝莧對(duì)氟磺胺草醚的抗性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 反枝莧; 氟磺胺草醚; 抗藥性機(jī)制

中圖分類號(hào)： S 481.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018406

Abstract To reveal the resistance mechanism of Amaranthus retroflexus L. to fomesafen， the enzyme assays of PPO， GSTs， POD， SOD， and CAT in both resistant （R） and susceptible （S） populations of A. retroflexus were performed. The results showed that the treatment of fomesafen inhibited the PPO activity in both R and S populations， and the PPO activity of R population could recover while that of the S population could not. After treatment with fomesafen， the activity changes of GSTs and SOD in both the R and S populations showed no obvious difference， while the POD and CAT activity was inhibited in both the R and S populations， and the POD and CAT activity in the R population could recover， while that of the S population could not. The results suggested that reduced sensitivity to PPO was one of the resistance mechanisms of A. retroflexus to fomesafen and the differences in the POD and CAT resistance to reactive oxygen species might also be related to the resistance of A. retroflexus to fomesafen.

Key words Amaranthus retroflexus; fomesafen; mechanism of resistance

根據(jù)國(guó)際抗除草劑雜草調(diào)查數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2018年9月13日，全球已有255種（148種雙子葉，107種單子葉）雜草的495個(gè)生物型，對(duì)70個(gè)國(guó)家的92種作物田的26種已知作用機(jī)制中的23種，共計(jì)163種除草劑產(chǎn)生了抗藥性，幾乎涵蓋各類重要的除草劑[1-2]。抗性雜草已成為雜草治理和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅，由其引發(fā)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)和安全問(wèn)題備受全球關(guān)注。

反枝莧Amaranthus retroflexus L.，別名西風(fēng)谷、野米谷等，是我國(guó)農(nóng)田、果園常見(jiàn)的一年生闊葉雜草[3-4]。目前防治該類雜草的主要藥劑是二苯醚類（diphenyl ether）除草劑，該類除草劑屬于原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑，具有除草效果好，殺草譜廣，選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)。然而，由于其連年大量使用，已導(dǎo)致多種雜草對(duì)其產(chǎn)生了抗性。截至2018年9月13日，在7個(gè)國(guó)家已有13種雜草對(duì)PPO抑制劑產(chǎn)生了抗性[1]。

氟磺胺草醚（fomesafen）是二苯醚類除草劑的主要品種之一，在我國(guó)大豆田應(yīng)用十分廣泛 [5-6]。但近年來(lái)，由于氟磺胺草醚的連年過(guò)量使用，防除反枝莧的效果開(kāi)始下降，有些地區(qū)用藥3次也難以達(dá)到理想的防除效果。目前，有關(guān)雜草對(duì)除草劑抗性機(jī)制的研究主要集中在以下2個(gè)方面：1）雜草對(duì)除草劑靶標(biāo)位點(diǎn)的敏感性發(fā)生改變;2）雜草代謝解毒能力增強(qiáng)。滕春紅等研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江省黑河市嫩江縣采集點(diǎn)的反枝莧對(duì)氟磺胺草醚產(chǎn)生了高水平抗性，溫室盆栽法測(cè)得其抗性倍數(shù)為101.74[7]。Wuerffel等采用等位基因特異性PCR擴(kuò)增了94個(gè)糙果莧A.tuberculatus種群的PPO基因，發(fā)現(xiàn)抗乳氟禾草靈生物型的PPX2L基因的第210位甘氨酸缺失，表明該位點(diǎn)缺失與糙果莧抗性生物體內(nèi)PPO敏感性降低相關(guān)[8]。

為了進(jìn)一步闡明反枝莧對(duì)氟磺胺草醚產(chǎn)生抗性的機(jī)制，為抗性雜草研究和治理提供理論依據(jù)，測(cè)定了氟磺胺草醚對(duì)抗性和敏感種群反枝莧體內(nèi)原卟啉原氧化酶（PPO）活性、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

反枝莧抗性種群（R）于2014年9-10月采自黑龍江省嫩江縣前進(jìn)鎮(zhèn)東升村大豆田，溫室盆栽法測(cè)得抗性生物型對(duì)氟磺胺草醚的抗藥性倍數(shù)為101.74[7];反枝莧敏感種群（S）于2014年9-10月采自黑龍江省牡丹江市東寧縣大肚川鎮(zhèn)非耕地，從未施用過(guò)除草劑。反枝莧經(jīng)鑒定后晾干，裝入牛皮紙袋，保存在4℃冰箱待用。

1.1.2 供試除草劑

250 g/L氟磺胺草醚水劑，大連松遼化工有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 供試試劑

甲硫氨酸 （Met）、四氮唑藍(lán)（NBT）、乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）、核黃素 （FD）、磷酸緩沖液、1%愈創(chuàng)木酚、30%H2O2溶液、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）、磷酸、無(wú)水乙醇、Tris-HCl緩沖液、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、NaOH、KNO3、還原型谷胱甘肽、1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）。

原卟啉原氧化酶（PPO）ELISA酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）。

1.1.4 供試儀器設(shè)備

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901）、酶標(biāo)儀（352型）高速冷凍離心機(jī)ST 16R、離心管、移液槍、石英比色皿、研缽。

1.2 方法

采用盆栽法。在每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中均勻播種20粒反枝莧種子，上面蓋2 cm細(xì)土并鎮(zhèn)壓。出苗后間苗，每盆保留10株。3～5葉期進(jìn)行莖葉處理，250 g/L氟磺胺草醚水劑的有效用藥量為150 g/hm2。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理4次重復(fù)，設(shè)置清水作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)2次。分別于施藥前、施藥后1、3、5、7和14 d剪取不同種群反枝莧葉片，稱重后作為試驗(yàn)樣品。樣品于-20℃保存，冰浴磨樣，分別測(cè)定PPO活性、GSTs活性、SOD、POD及CAT活性。

1.2.1 PPO活性的測(cè)定

PPO活性測(cè)定按照酶活性檢測(cè)試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）步驟進(jìn)行，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性的測(cè)定

參照Pamela等、陶波等[9-10]的方法并改進(jìn)，取0.2 g反枝莧葉片制成待測(cè)酶液。取0.5 mL 3.0 mol/L谷胱甘肽溶液，加入2.3 mL 0.1 mol/L pH=6.5的磷酸緩沖液，加入50 μL上述待測(cè)酶液，最后加入20 mmoL/L的CDNB 0.15 mL，并設(shè)蒸餾水對(duì)照調(diào)零。在340 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光值在2 min內(nèi)的變化，并記錄OD值。以1 mg/L蛋白10 min催化反應(yīng)，吸光值變化0.001為一個(gè)酶活性單位（1U），以1 mg/L可溶性蛋白的含量表示為GSTs酶活性。

1.2.3 SOD、POD和CAT活性測(cè)定

分別取0.2 g反枝莧葉片制成待測(cè)酶液。參照并改進(jìn)Giannoplitis等[11]的方法測(cè)定SOD活性，在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管的吸光度，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原50%為一個(gè)酶活性單位（U）表示酶活力;參照并改進(jìn)郝再彬等[12]的方法測(cè)定POD活性，在470 nm波長(zhǎng)下比色，每隔1 min記錄一次，記錄3 min內(nèi)的變化值，以吸光度變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U）表示酶活力;參照并改進(jìn)劉亞光等[13]的方法測(cè)定CAT活性，在240 nm下比色，每隔1 min記數(shù)一次，共讀數(shù)3次，以每分鐘吸光度的變化值表示酶活力的大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Excel 2010做折線圖，以標(biāo)準(zhǔn)差定義誤差線。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群PPO活性的影響

氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群PPO活性的影響如圖1所示。施藥前R種群的PPO活性是S種群的1.42倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群的PPO活性均隨著處理時(shí)間的增加呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，R種群在處理3 d到14 d一直高于或接近對(duì)照水平，S種群的PPO活性一直低于對(duì)照水平。施藥后14 d，R種群和S種群的PPO活性分別比對(duì)照組降低了6.41%和47.44%。

2.2 氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群GSTs活力的影響

氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群GSTs活性的影響如圖2所示。施藥前R種群的GSTs活性是S種群的1.92倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群GSTs活性隨著施藥天數(shù)的增加呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)。施藥后14 d，R種群和S種群GSTs活性分別比對(duì)照組降低了9.51%和11.54%。

2.3 氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群SOD活性的影響

氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群SOD活性的影響如圖3所示。施藥前R種群SOD活性是S種群的1.45倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群SOD活性隨著施藥天數(shù)的增加呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)。R種群和S種群均可以恢復(fù)到接近對(duì)照水平。施藥后14 d，R種群和S種群SOD活性分別比對(duì)照組降低了2.13%和3.94%。

2.4 氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群POD活性的影響

氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群POD活性的影響如圖4所示。施藥前R種群的POD活性是S種群的1.55倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群的POD活性均隨著施藥天數(shù)的增加呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)。施藥后14 d，R種群的POD活性比對(duì)照組增加了8.02%，S種群的POD活性比對(duì)照組減少了14.63%。

上述結(jié)果表明，在受到氟磺胺草醚脅迫后，R種群POD活性能逐漸恢復(fù)并增強(qiáng)來(lái)防御活性氧對(duì)植物組織內(nèi)細(xì)胞膜的傷害，而S種群則不能恢復(fù)。

2.5 氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群CAT活性的影響

氟磺胺草醚對(duì)不同反枝莧種群CAT活性的影響如圖5所示。施藥前R種群CAT活性是S種群的1.57倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群CAT活性隨著施藥天數(shù)的增加呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)。施藥后14 d，R種群和S種群的CAT活性分別比對(duì)照組降低了3.21%和13.83%。

上述結(jié)果表明，在受到氟磺胺草醚脅迫后，R種群和S種群的CAT活性均受到抑制，R種群CAT活性能逐漸恢復(fù)來(lái)防御活性氧對(duì)植物組織內(nèi)細(xì)胞膜的傷害，而S種群則不能恢復(fù)。

3 結(jié)論與討論

靶標(biāo)酶活性、代謝酶GSTs活性以及保護(hù)酶（SOD、POD、CAT）活性是衡量除草劑對(duì)雜草脅迫情況的重要指標(biāo)[14-15]。氟磺胺草醚屬于二苯醚類除草劑，該類除草劑的作用靶標(biāo)是原卟啉原氧化酶（PPO），此類除草劑主要通過(guò)抑制葉綠素生物合成途徑中合成四吡咯所必需的原卟啉原氧化酶來(lái)防治雜草[16]。氟磺胺草醚處理后，抗性和敏感反枝莧種群PPO活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復(fù)，而敏感種群則不能恢復(fù)。說(shuō)明氟磺胺草醚對(duì)反枝莧抗性種群PPO活性的抑制作用不明顯，而對(duì)敏感種群PPO活性的抑制作用較大。

GSTs在雜草對(duì)除草劑的抗藥性中起著非常重要的作用[17]。王笑等認(rèn)為GSTs的類型和活性的大小可作為植物抗除草劑能力的一個(gè)重要指標(biāo)[18-20]。氟磺胺草醚脅迫后，R種群和S種群GSTs活性均受到抑制，然后通過(guò)逐漸提高活性來(lái)減少這種抑制作用，但不能恢復(fù)到對(duì)照水平。R、S種群GSTs活性變化趨勢(shì)基本一致，不存在明顯差異。說(shuō)明反枝莧體內(nèi)GSTs對(duì)進(jìn)入到葉片組織中的氟磺胺草醚有一定的代謝能力，從而部分地減弱氟磺胺草醚對(duì)反枝莧組織的傷害。

植物體內(nèi)存在著許多種抗氧化酶，SOD、POD及CAT在清除植物體內(nèi)活性氧對(duì)植物細(xì)胞質(zhì)膜以及細(xì)胞膜等膜系統(tǒng)的傷害方面起著重要作用[21]。許多研究表明，在抗性雜草種群中代謝解毒酶SOD、POD及CAT活性增強(qiáng)[13，22-23]。氟磺胺草醚脅迫后，R、S種群的SOD活性均受到抑制，而后SOD活性逐漸恢復(fù)來(lái)防御活性氧對(duì)植物組織內(nèi)細(xì)胞膜的傷害，抗性和敏感反枝莧種群SOD活性變化無(wú)明顯差異，R、S種群的POD和CAT活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復(fù)，而敏感種群則不能恢復(fù)。這與劉亞光等研究稗草種群對(duì)莠去津、乙草胺和硝磺草酮的抗性機(jī)理及馬紅等研究野黍?qū)熰谆锹〉目剐詸C(jī)理的結(jié)果相似[13，23]。

細(xì)胞色素酶系在除草劑的選擇性和雜草抗藥性方面也發(fā)揮著重要的作用[8]，而抗氟磺胺草醚反枝莧生物型體內(nèi)P450 酶系活性的變化規(guī)律還有待于進(jìn)一步研究。反枝莧對(duì)氟磺胺草醚抗性的分子機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] HEAP I. The international survey of herbicide-resistant weeds[R/OL].[2018-09-13]. http：∥www.weedscience.org/.

[2] 蘇少泉， 滕春紅. 雜草對(duì)除草劑的抗性現(xiàn)狀、發(fā)展與治理[J]. 世界農(nóng)藥， 2013， 35（6）： 1-6.

[3] 魯萍， 梁慧， 王宏燕， 等. 外來(lái)入侵雜草反枝莧的研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2010， 29（8）： 1662-1670.

[4] 陳金奕， 張朝賢， 黃紅娟， 等. 反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸抗性水平及分子機(jī)制[J]. 植物保護(hù)， 2015， 41（2）： 130-134.

[5] 白杰， 韓玉軍， 祖永平， 等. 氟磺胺草醚毒害玉米的生理指標(biāo)分析[J]. 玉米科學(xué)， 2014， 22（3）： 81-85.

[6] 郭玉蓮， 宋偉豐， 李明， 等. 不同玉米品種對(duì)氟磺胺草醚的敏感性差異[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 45（11）： 14-21.

[7] 滕春紅， 崔書(shū)芳， 譚洪鶴， 等. 黑龍江省大豆田反枝莧對(duì)氟磺胺草醚的抗藥性[J]. 農(nóng)藥， 2016， 55（5）： 380-383.

[8] WUERFFEL R J， YOUNG J M， LEE R M， et al. Distribution of the △G210 protoporphyrinogen oxidase mutation in Illinois waterhemp （Amaranthus tuberculatus） and an improved molecular method for detection[J].Weed Science， 2015， 63：839-845.

[9] PAMELA J H， DAVID D. Glutathione transferase activities and herbicide Selection in maize and associated weed species[J]. Pesticide science，1996，46（3）：267-275.

[10] 陶波， 向文勝， 王萍， 等. 作保靈（TNA）對(duì)水稻的保護(hù)作用及作用機(jī)理研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2000 （1）： 53-57.

[11] GIANNOPOLITIS C N，RIES S K. Superoxide dismutase： II. purification and quantitative relationship with water-soluble protein in seedlings [J]. Plant Physiology， 1977， 59（2）：315-318.

[12] 郝再彬， 蒼晶， 徐仲. 植物生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 哈爾濱： 哈爾濱出版社， 2002.

[13] 劉亞光，唐興佳，劉藍(lán)坤，等. 黑龍江省稗草對(duì)三種玉米田常用除草劑抗藥性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018，49（4）：29-39.

[14] POWLES S B， YU Q. Evolution in action： plants resistant to herbicides[J].Annual Review of Plant Biology，2010，61：317-347.

[15] 畢亞玲， 劉君良， 王兆振， 等. 麥田抗性生物型薺菜對(duì)苯磺隆的抗性機(jī)制研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 15（2）： 171-177.

[16] SHOUP D E， ALKHATIB K， PETERSON D E. Common waterhemp （Amaranthus rudis） resistance to protoporphyrinogen oxidase-inhibiting herbicides [J]. Weed Science， 2003， 51（2）：145-150.

[17] 馬鵬生.豬殃殃抗雙氟磺草胺的生理機(jī)制研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2014（5）： 778-781.

[18] 王笑. 稗草谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（EcGSTs）的克隆和表達(dá)分析[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

[19] 裴冬麗. 谷胱甘肽還原酶在植物防御中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（18）：185-188.

[20] 陳秀華， 王臻昱， 李先平，等. 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013（1）：149-153.

[21] 彭學(xué)崗.北方部分冬麥區(qū)雜草豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗藥性研究[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[22] PEIXOTO F， ALVES-FERNANDES D， SANTOS D， et al. Toxicological effects of oxyfluorfen on oxidative stress enzymes in tilapia Oreochromis niloticus [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2006， 85（2）：91-96.

[23] 馬紅， 馬誠(chéng)義， 賈金蓉， 等. 野黍?qū)熰谆锹〉目剐匝芯縖J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018，49（1）： 47-55.

（責(zé)任編輯： 田 喆）