枯草芽胞桿菌發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病的防治效果

翟世玉 殷輝 周建波

摘要 為明確來自蘋果樹上的1株生防菌LF17對腐爛病菌的抑制作用及其發(fā)酵液對腐爛病的防治效果，采用形態(tài)學(xué)結(jié)合16S rDNA和gyrA基因序列分析對菌株LF17進(jìn)行了鑒定，并通過濾紙法測定了發(fā)酵液對腐爛病菌的抑制率，利用涂抹發(fā)酵液的方法測定了發(fā)酵液對腐爛病的防效。結(jié)果表明，菌株LF17發(fā)酵液對腐爛病菌的抑菌率為93.80%，與甲基硫菌靈（94.20%）抑菌率相當(dāng)，顯著高于嘧菌酯（42.60%）、辛菌胺（52.80%）和苯醚甲環(huán)唑（81.30%）;離體枝條防治結(jié)果表明，發(fā)酵液水劑和膏劑對腐爛病的防效為78.59%～80.40%，與甲基硫菌靈（76.93%）相比差異不顯著，與嘧菌酯（44.15%）、辛菌胺（68.25%）、苯醚甲環(huán)唑（74.45%）相比差異顯著;田間試驗(yàn)表明，涂有發(fā)酵液的傷口愈合面積為9.37～9.79 cm2，病疤復(fù)發(fā)率為3.82%～4.56%，與其他4種藥劑相比差異顯著。研究表明菌株LF17發(fā)酵液對腐爛病菌有明顯抑制作用，且可促進(jìn)傷口的愈合并顯著降低腐爛病的復(fù)發(fā)。

關(guān)鍵詞 蘋果樹腐爛病; 枯草芽胞桿菌; 發(fā)酵液; 抑菌率; 防治效果

中圖分類號： S 436.611.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018376

Abstract The objective is to define the inhibitory effect of a strain LF17 isolated from apple trees and the control efficacy of the fermentation broth against the apple Valsa canker. Based on the morphological characteristics， 16S rDNA and gyrA sequence analysis， the strain LF17 was defined as Bacillus subtilis. The inhibition rate and control efficacy of fermentation broth on V.mali was tested by filter paper method and daubing fermentation broth， respectively. The results showed that the inhibition rate of fermentation broth against V. mali was 93.80%， which was similar to that of thiophanate-methyl （94.20%）， but significantly higher than those of azoxystrobin （42.60%）， xinjunan （52.80%） and difenoconazole （81.30%）. Control efficacy test on excised twigs showed that the inhibition rate of fermentation broth against apple Valsa canker was 78.59%-80.4%，which was no obvious difference with that of thiophanate-methyl （76.93%）， but significantly different from those of azoxystrobin （44.15%）， xinjunan （68.25%） and difenoconazole （74.45%）. Field experiment showed that the healing area of fermentation broth was 9.37-9.79 cm2， and the recurrence rate of apple Valsa canker was 3.82%-4.56%， which was significantly higher than chemicals. The results indicated that the fermentation broth of LF17 had a significant inhibitory effect on V. mali. It can effectively stimulate the wound healing and remarkably reduce the recurrence of apple Valsa canker.

Key words apple Valsa canker; Bacillus subtilis; fermentation broth; inhibition rate; control efficacy

蘋果樹腐爛病（apple Valsa canker）是對我國蘋果危害范圍非常廣的毀滅性病害之一，該病由黑腐皮殼屬Valsa spp.真菌引起，導(dǎo)致蘋果枝干發(fā)病，嚴(yán)重制約著蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。在很長一段時(shí)間內(nèi)，生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)藥劑防治蘋果樹腐爛病，致使果園生態(tài)環(huán)境惡化，且出現(xiàn)腐爛病菌的抗藥性菌株[3-4]。現(xiàn)階段生物防治蘋果樹腐爛病是國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。

郜佐鵬等[5]、鄧振山等[6]、徐濤等[7]、蔡光華等[8]和王彩霞等[9]從土壤、蘋果樹及其他植物中篩選出的放線菌、真菌、細(xì)菌PG-10-8-11v、微嗜酸寡氧單胞菌等對蘋果樹腐爛病菌有較好的抑制作用。在蘋果樹腐爛病菌的拮抗菌中，芽胞桿菌是被篩選鑒定較多的類群[10-12];其中短小芽胞桿菌Bacillus pumilus[13]、解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens[14]、枯草芽胞桿菌B.subtilis[15]對腐爛病菌都有較好的抑制作用。目前，國內(nèi)外研究者主要側(cè)重芽胞桿菌的篩選鑒定和其對腐爛病菌的抑菌作用[16-17]。關(guān)于枯草芽胞桿菌防治腐爛病的田間研究較少。2015年，Zhang等通過田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌對腐爛病有較好的防控效果[14]。

生產(chǎn)中有少量商品化的芽胞桿菌生物制劑用于防治腐爛病[18]。較為成功的產(chǎn)品是以枯草芽胞桿菌（Bs-0728）為主要菌群研發(fā)的菌肥木美土里，根施該菌肥可提高蘋果樹的抗病性、顯著降低腐爛病的發(fā)病率;使用菌泥治療腐爛病，其對傷口愈合有良好的促進(jìn)作用[19]。枯草芽胞桿菌已經(jīng)顯示出作為腐爛病生防菌的巨大潛力[20-23]。本研究對菌株LF17進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)行了其對蘋果腐爛病菌抑制率測定及對蘋果枝條腐爛病的防治效果試驗(yàn)，以期探索該生防菌株對腐爛病的防控效果以及對傷口愈傷組織形成的作用，為腐爛病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：本研究選取對腐爛病菌抑制效果較好的代表性菌株LF17進(jìn)行系統(tǒng)研究，菌株從山西省蘋果產(chǎn)區(qū)臨汾市蘋果園的樹枝干上分離獲得;蘋果樹腐爛病菌Valsa mali 菌株編號YC90，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害研究室保存。

本研究供試培養(yǎng)基、化學(xué)藥劑及發(fā)酵液見表1。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離及鑒定

采用劃線法分離菌株，28℃培養(yǎng)20 h挑取單菌落。純化后的菌株28℃培養(yǎng)3 d，記錄菌落形態(tài)，4℃保存?zhèn)溆谩⒖纪跣l(wèi)雄等利用16S rDNA[15]和gyrA序列結(jié)合菌株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

1.2.2 芽胞染色

挑取單菌落，涂片經(jīng)火焰固定后滴加5%孔雀綠水溶液加熱30～60 s使其產(chǎn)生蒸汽4次，水洗至無色，0.5%番紅水溶液復(fù)染2 min，水洗至無色，待載玻片晾干后油鏡鏡檢[27]。

1.2.3 發(fā)酵液和4種化學(xué)藥劑對腐爛病菌的抑制作用

采用對峙法[28]篩選獲得1株拮抗菌LF17，活化LF17后接種于NB培養(yǎng)基，150 r/min、28℃培養(yǎng)3 d獲得發(fā)酵液，4℃保存?zhèn)溆谩２捎脼V紙法[29]測定發(fā)酵液原液的抑菌率，將直徑為1.00 cm無菌濾紙片放入發(fā)酵液和無菌水中浸泡2 h后取出，置于無菌超凈工作臺(tái)吹干。在PDA培養(yǎng)基平板中間接種直徑為0.50 cm的腐爛病菌菌餅，再將浸泡過發(fā)酵液的濾紙片放到平板邊緣距中心2.50 cm處，每皿對稱放4片，重復(fù)3次，無菌水處理為對照，于28℃培養(yǎng)，待對照平板長滿菌絲后測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。對峙培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中距離腐爛病菌菌餅0.50 cm處插入蓋玻片，培養(yǎng)7 d后觀察腐爛病菌菌落、菌絲等的變化。

采用菌絲生長速率法測定4種化學(xué)藥劑對腐爛病菌菌絲生長的影響，含藥培養(yǎng)基制備參考周建波等[30]的方法。置于28℃下培養(yǎng)，以只接種腐爛病病原菌的平板為對照，每處理3次重復(fù)。待對照平板上長滿菌絲后測量菌落直徑。抑菌率計(jì)算方法參考鄧振山等[6]。

抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）對照組菌落直徑×100%。

1.2.4 LF17發(fā)酵液和化學(xué)藥劑對離體枝條抑菌活性測定

將原發(fā)酵液加入吐溫80制成水劑，吐溫80的含量為溶液質(zhì)量的2%，裝瓶備用;將原發(fā)酵液每100 mL加入9 g黃原膠，制成黃原膠含量為0.6%的膏劑，裝瓶備用。水劑和膏劑中的芽胞含量為108 cfu/mL。

參考臧睿等[31]的燙傷接種法，選取2年生背上枝，截成120 cm作為接種材料，端口封蠟、自來水沖洗2次后，用75%乙醇表面消毒，無菌水沖洗3次。用鐵釘冒（直徑為0.50 cm）燙傷樹皮，每個(gè)枝條5個(gè)燙傷口、相距20.00 cm，4個(gè)傷口接腐爛病菌，1個(gè)為對照;每個(gè)處理接種3個(gè)枝條。在接種部位上方1～2 cm處加一塊無菌水浸濕的脫脂棉，用塑料薄膜將其和接種體包扎好。接種后將枝條扦插于含水量約40%的無菌細(xì)沙中，在溫度25℃、相對濕度約40%條件下培養(yǎng)。

待傷口擴(kuò)展后，挑選病斑擴(kuò)展長度為（1.00±0.30）cm的枝條進(jìn)行離體枝條腐爛病菌抑菌試驗(yàn)。用小刀在病斑處刻線，深至木質(zhì)部。縱橫交錯(cuò)，距離約0.50 cm。將傷口刻好線后，用毛筆在燙傷部位涂抹發(fā)酵液、發(fā)酵液膏劑、發(fā)酵液水劑及4種化學(xué)藥劑（廠家推薦劑量），NB培養(yǎng)基作為對照。處理后的枝條插入含水量約40%的無菌細(xì)沙中，于25℃保濕培養(yǎng)10 d，觀察記錄枝條的發(fā)病情況，測量病斑長度，計(jì)算防治效果、試驗(yàn)重復(fù)3次。

防治效果=

（對照組病斑長度-處理組病斑長度）對照組病斑長度×100%。

1.2.5 LF17發(fā)酵液和化學(xué)藥劑對蘋果腐爛病的田間防效試驗(yàn) ?2016年的3月進(jìn)行田間防治試驗(yàn)。首先對病組織進(jìn)行刮治，刮治時(shí)徹底刮除病組織、深至木質(zhì)部，四周外延0.50 cm，盡量使刮治傷口縱長、橫窄，切面光滑。刮除病組織后，分別涂抹上述配制好的發(fā)酵液、發(fā)酵液膏劑、發(fā)酵液水劑及4種化學(xué)藥劑（廠家推薦劑量）使其完全覆蓋刮治后的傷口并外延1.50 cm，處理后每隔10 d再涂1次，共3次。以NB培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)處理20個(gè)病疤，3個(gè)月后測量傷口愈合面積，次年3月調(diào)查病疤復(fù)發(fā)情況。愈合面積采用坐標(biāo)紙法[32]，用一張紙?jiān)趥诳偯娣e部位外圍和內(nèi)部未愈合部位外圍畫外圍線，然后把兩個(gè)周線描繪在單個(gè)方格為1 cm2的坐標(biāo)紙上，計(jì)算愈合面積。病疤復(fù)發(fā)率計(jì)算參考曹欣然等[33]，公式如下。

病疤復(fù)發(fā)率=病疤累計(jì)復(fù)發(fā)病塊數(shù)調(diào)查病疤總塊數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進(jìn)行圖表數(shù)據(jù)處理，并采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌鑒定

2.1.1 拮抗菌形態(tài)學(xué)特征

菌株LF17在28℃下培養(yǎng)3 d 可出現(xiàn)明顯菌落，其形狀不規(guī)則、初期白色，后期為黃褐色、中央略突起、不透明、表面粗糙，產(chǎn)芽胞，鏡檢芽胞呈橢圓形或桿狀（圖1）。

2.1.2 基于16S rDNA和gyrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

利用16S rDNA序列，以B.licheniformis為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分離菌株LF17和B.subtilis（JQ 361067、KF496886、GU722647等）以98%自展支持率聚為同一個(gè)分支（圖2），表明其與B.subtilis的親緣關(guān)系較近。

利用gyrA基因序列，以B.licheniformis為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分離菌株LF17和B.subtilis（JX 977128、JX 977131、JX 977130等）以100%自展支持率聚為同一個(gè)分支（圖3），表明其與B.subtilis的親緣關(guān)系較近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、16S rDNA和 gyrA 基因序列分析結(jié)果，將菌株LF17鑒定為B.subtilis。

2.2 發(fā)酵液與4種化學(xué)藥劑的抑菌效果及對腐爛病菌菌絲形態(tài)的影響 ?供試4種化學(xué)藥劑對腐爛病菌（菌株YC90）的抑菌率范圍為42.60%～94.20%，其中苯醚甲環(huán)唑和甲基硫菌靈的抑菌率較高，分別為81.30%和94.20%、二者差異顯著;嘧菌酯和辛菌胺抑菌率較低，二者差異顯著;菌株LF17發(fā)酵液的抑菌率為93.80%，和甲基硫菌靈對腐爛病菌的抑菌率相當(dāng)、二者差異不顯著，發(fā)酵液與嘧菌酯、辛菌胺、苯醚甲環(huán)唑3種藥劑相比差異顯著（圖4）。

腐爛病菌與菌株LF17對峙培養(yǎng)7 d后，相比對照腐爛病菌落呈深褐色;菌絲為褐色、頂端膨大、粗細(xì)不均勻、分支增多，部分菌絲細(xì)胞質(zhì)外滲（圖5）。

2.3 LF17發(fā)酵液和化學(xué)藥劑對離體枝條的防治效果

供試4種化學(xué)藥劑對腐爛病防治效果為44.15%～76.93%、病疤平均長度范圍為2.23～5.40 cm，其中苯醚甲環(huán)唑和甲基硫菌靈對腐爛病的防效較好，分別為74.45%和76.93%、二者差異不顯著;嘧菌酯和辛菌胺防效較低，二者差異顯著。

發(fā)酵液和辛菌胺對腐爛病病疤的防效分別為71.76%和68.25%，二者差異顯著;發(fā)酵液膏劑、水劑對腐爛病的防治效果最好，分別為78.59%和80.04%，二者差異不顯著，與甲基硫菌靈相比差異不顯著，與其他3種藥劑相比差異均顯著，病疤平均長度分別為2.07 cm和1.93 cm，二者差異不顯著，與甲基硫菌靈相比差異不顯著，與其他3種藥劑相比差異均顯著（圖6）。

2.4 LF17發(fā)酵液和化學(xué)藥劑對蘋果腐爛病的田間防治效果 ?使用4種化學(xué)藥劑后腐爛病復(fù)發(fā)率為8.83%～27.92%、病疤愈合面積為4.96～6.63 cm2，其中甲基硫菌靈防治腐爛病后復(fù)發(fā)率為8.83%，顯著低于其他3種藥劑處理的復(fù)發(fā)率;嘧菌酯和辛菌胺復(fù)發(fā)率較高，分別為27.92%和21.31%，二者差異顯著。

發(fā)酵液、發(fā)酵液膏劑、發(fā)酵液水劑防治腐爛病后復(fù)發(fā)率較低，均在4.50%以下，顯著低于4種化學(xué)藥劑的復(fù)發(fā)率;涂抹發(fā)酵液的傷口愈合面積均在9.00 cm2以上，其中涂抹發(fā)酵液膏劑的傷口愈合效果最好，達(dá)到9.79 cm2，發(fā)酵液和發(fā)酵液水劑處理的傷口愈合面積分別為9.23 cm2和9.37 cm2，二者差異不顯著（圖7～8）。

3 結(jié)論與討論

枯草芽胞桿菌天然存在于自然界，其中很多菌株具有防病及促生作用，被廣泛地開發(fā)應(yīng)用[34]。本試驗(yàn)篩選、鑒定來自蘋果樹皮上1株對腐爛病菌抑菌率高的枯草芽胞桿菌，經(jīng)離體枝條和田間試驗(yàn)表明其發(fā)酵液可有效防治蘋果樹腐爛病。拮抗細(xì)菌對真菌的主要作用是抑制分生孢子的萌發(fā)和菌絲生長[35-36]，這也與本研究結(jié)果一致。菌株LF17發(fā)酵液顯著抑制腐爛病菌菌絲生長，效果較好，可有效防治腐爛病，具有生防應(yīng)用意義。

生產(chǎn)中主要采用刮治并涂抹化學(xué)藥劑防治蘋果樹腐爛病。本研究供試的4種化學(xué)藥劑在室內(nèi)均表現(xiàn)出較高的抑菌活性，然而田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)刮治并涂抹化學(xué)藥劑后傷口愈合能力差，長期裸露易滋生病菌，病疤復(fù)發(fā)率高。

本試驗(yàn)使用刮治并涂抹生防菌發(fā)酵液防治蘋果樹腐爛病，表明可促進(jìn)傷口的愈合并顯著降低腐爛病的復(fù)發(fā)。枯草芽胞桿菌發(fā)酵液中含有能促進(jìn)傷口愈合的物質(zhì)，傷口部位被愈傷組織完全封閉，能有效阻止腐爛病的復(fù)發(fā)[36]。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的田間防效好于化學(xué)藥劑。因此，在果樹休眠期采用傷口刮治結(jié)合涂抹生防菌劑的方法是理想的防治手段。此外，因?yàn)橥聹乜墒共蝗芑螂y溶的液體形成穩(wěn)定的乳濁液，所以有助于發(fā)酵液滲透到樹皮下有效與病原菌接觸，提高防治效果[37];黃原膠起到乳化、穩(wěn)定、凝膠增稠的作用，使得發(fā)酵液膏劑不容易蒸發(fā)，耐雨水沖洗[38]，有助于發(fā)酵液在傷口處定殖進(jìn)而抑制腐爛病菌。

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