儲存紅細胞輸注增強細菌感染引發的肝損傷研究*

吳 濤 陳 震 張秋麗 晉 晶 張艷春 史榮輝 付秋霞 詹林盛

機體各重要器官，尤其是肝臟，在膿毒血癥的發生發展過程中具有重要作用。同時，肝臟在衰老紅細胞懸液(red blood cell suspension，RBCs)的清除中也發揮著重要的作用，是快速清除RBCs和鐵循環的主要器官。雖然，懸浮RBCs輸注可能挽救一部分患者的生命，但在不同的膿毒血癥及膿毒性休克患者中，RBCs輸注可能增加患者的病死率[1-2]。根據肝臟在膿毒血癥及RBCs清除中的調節活性及“儲存紅細胞誘導創傷后炎癥并增強感染”的理論[3]推測：儲存RBCs輸注增強細菌感染并引發膿毒血癥，可能與儲存RBCs輸注加重細菌感染引發的肝損傷密切相關。為對上述推測進行驗證，本研究將基于可視化監測技術監測儲存RBCs促進膿毒血癥并引發肝損傷的作用過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用雄性C57BL/6小鼠50只，6～8周齡，體重為18～22 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，在軍事醫學科學院實驗動物中心無特定病原體(specific pathogen free，SPF)飼養間進行飼養。

1.2 儀器設備

采用IVIS 50型活體熒光成像儀(美國Caliper公司)；TBA-200FR型血清生物化學分析儀(日本Toshiba公司)；VIP-6型脫水機(日本櫻花公司)；KD-BM型包埋機(科迪儀器設備有限公司)；RM2016型病理切片機(德國萊卡公司)；KD-P型組織攤片機(科迪儀器設備有限公司)；KPJ-14型烤片機(天津愛華公司)；DH3600型恒溫箱(天津泰斯特儀器有限公司)；Nikon Ci-S型顯微鏡(日本尼康公司)；DS-FI2型成像系統(日本尼康公司)；THZ-C型恒溫振蕩器(江蘇太倉實驗設備廠)；BCD-165C型冰箱(韓國三星公司)；3K15型臺式冷凍離心機(美國Sigma公司)。

1.3 試劑及材料

甲醛溶液、二甲苯、石蠟(濟寧百川化工有限公司)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；異氟烷(山東科源制藥有限公司)；188105載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實驗器材廠)；50 ml Falcon離心管(美國BD公司)；24 G、26 G注射器(江蘇海門公司)。

1.4 細菌感染

用小鼠固定器分別固定6只小鼠，用酒精對鼠尾進行消毒。用注射器吸取準備好的細菌溶液。選擇進針點，注射器針頭穿刺入尾靜脈，向前推進約2～3 mm。通過尾靜脈注射細菌200 μl感染每只實驗小鼠。注射結束后將小鼠放回籠中繼續飼養。

1.5 小鼠單個組織器官活體成像

在注射細菌后0.5 h、1 h、2 h、4 h、12 h和24 h，使用1%～3%異氟烷麻醉小鼠，斷頸處死小鼠，迅速將小鼠解剖，摘取小鼠的心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟和腸，置于活體成像儀中成像1～5 min(發光強弱決定成像時間)。

1.6 RBCs輸血和細菌感染

將20只小鼠分4組，每組5只，用小鼠固定器分別固定小鼠，用酒精對鼠尾進行消毒。用注射器吸取準備好的細菌溶液。選擇進針點，注射器針頭穿刺入尾靜脈，向前推進約2～3 mm。通過尾靜脈注射細菌200 μl感染每只實驗小鼠。RBCs懸浮液稀釋調整至血紅蛋白濃度為17.0～17.5 g/dL。將400 μl RBCs通過異氟烷麻醉小鼠的眼后靜脈叢輸注。注射結束后將小鼠放回籠中繼續飼養。

1.7 小動物活體成像

將實驗動物放入氣體麻醉箱中，打開麻醉氣體開關，用1%～3%異氟烷麻醉。待實驗動物停止活動后，將其放入活體成像儀中，打開麻醉氣體開關，并保持1%～2%的異氟烷持續麻醉。根據注射細菌數量不同，選取自動活體成像模式，1～5 min不等，成像結束后，將實驗動物放回動物飼養箱中。

1.8 肝功能測定

通過尾靜脈注射細菌200 μl感染每只實驗小鼠。將400 μl(新鮮或儲存RBCs)通過異氟烷麻醉小鼠的眼后靜脈叢輸注。注射結束后將小鼠放回籠中繼續飼養。在不同時間點用毛細吸管于小鼠眼眶取血。血液凝固后，離心取血清用于檢測。血清生物化學分析儀測定血清丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)。

1.9 肝臟蘇木精-伊紅(HE)染色

解剖并完整取出小鼠肝組織，于10%甲醛溶液中固定72 h以上。肝組織塊用流水沖洗，用低到高濃度的乙醇浸泡，逐級脫水，二甲苯滲透。上機切取石蠟包埋的組織塊，獲得厚度為5 μm的組織切片。切片脫蠟后，浸入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，再將切片浸入蘇木精染液中染色，10～30 min取出，用流水沖洗去掉浮色。切片浸入0.1%鹽酸酒精中數秒，流水沖洗至變藍，隨后再將切片浸入1%伊紅染液中復染2 min，洗去殘存染料。將切片經由低濃度到高濃度順序，用乙醇逐級脫色。將切片浸入100%的乙醇15 min，再浸入二甲苯+100%乙醇(1∶1)中，透明5～10 min，最后經二甲苯透明5 min后中性樹脂固片。使用CI-S型顯微鏡和DS-FI2型成像系統(Nikon)捕獲圖像。

1.10 統計學方法

數據資料采用SPSS17.0統計學軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差()表示，兩兩比較采用t檢驗。多組比較，組間方差齊時采用單因素多水平設計定量資料方差分析；組間方差不齊時，采用非參數檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 活體熒光成像觀察細菌感染后的器官分布

銅綠假單胞菌感染C57BL/6小鼠的生物發光成像(bioluminescence imaging，BLI)，顯示細菌的器官分布情況。小鼠注射2×108CFU細菌，并在注射后指定的時間點成像。感染的器官包括心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟和腸在解剖后單獨成像。由于信號的差異，在每種情況下使用相同的輻射標度。見圖1和圖2。

圖1 C57BL/6感染小鼠的器官分布情況

圖2 C57BL/6感染小鼠的BLI

2.2 儲存RBCs輸注增強銅綠假單胞菌誘導的肝損傷

銅綠假單胞菌感染C57BL/6小鼠，儲存RBCs輸注誘導增加肝臟損傷。在指定的感染后1 h、2 h、3 h和8 h時間點，收獲肝樣品和血清(5只/組)。檢測血清AST和ALT水平。所顯示的數據代表平均值±均值的標準誤差(standard error of mean，SEM)，新鮮紅細胞和儲存紅細胞的AST與ALT水平比較差異有統計學意義(t=4.833，P＜0.05)，見圖3。

銅綠假單胞菌感染C57BL/6小鼠，不同儲存時間RBCs輸注誘導對肝臟損傷的影響。在指定的時間點，收獲肝樣品和血清(5/組)。檢測新鮮RBCs及儲存3 d、7 d和14 d的RBCs輸注小鼠血清中的ALT和AST水平。所顯示的數據代表平均值±SEM，不同儲存時間RBCs輸注后ALT與AST水平比較差異有統計學意義(t=7.432，P＜0.05)，見圖4。

圖3 感染C57BL/6小鼠及不同儲存時間RBCs輸注小鼠血清中的ALT和AST水平

圖4 C57BL/6感染小鼠及3 d、7 d和14 d儲存時間RBCs輸注小鼠血清中的ALT和AST水平

銅綠假單胞菌感染C57 BL/6 小鼠，輸血后CPDA-1輸注對肝臟損傷的影響。小鼠輸血后早期和晚期輸注CPDA-1的ALT和AST血清水平。所顯示的數據代表平均值±SEM(5只/組)，見圖5。

圖5 感染C57BL/6小鼠輸血后CPDA-1輸注對小鼠輸血后早期和晚期血清ALT和AST水平的影響

銅綠假單胞菌感染C57BL/6小鼠，在小鼠膿毒血癥早期和晚期輸血對肝臟損傷的影響。在小鼠膿毒血癥早期和晚期輸血的ALT和AST的血清水平。所顯示的數據代表平均值±SEM(5只/組)，見圖6。

RBCs輸注銅綠假單胞菌感染C57BL/6小鼠的組織學檢查。小鼠肝臟切片的HE染色顯示肝損傷的組織學檢查見圖7。

圖6 C57BL/6感染小鼠在膿毒血癥早期和晚期輸血后血清ALT和AST水平

圖7 正常C57BL/6小鼠及新鮮與儲存RBCs輸注C57BL/6感染小鼠的組織學檢查(×200)

3 討論

為了更好地理解感染期間銅綠假單胞菌的生物分布和器官積聚，小鼠靜脈內注射銅綠假單胞菌，然后通過生物發光成像分析熒光素酶陽性器官。數據表明銅綠假單胞菌注射誘導的熒光素酶信號在肝區域中最強，隨后是肺和脾，在腸中可以檢測到相當少的銅綠假單胞菌，而在心臟和腎臟中檢測到的更少。這些觀察結果與以前的報道一致，表明注射給動物的細菌在注射后不久可能被肝臟捕獲。本研究證實，肝臟是銅綠假單胞菌沉積的主要組織，膿毒血癥后的肝功能障礙是膿毒血癥誘導死亡的獨立危險因素，項目組探討加重的膿毒血癥和降低的存活率是否依賴于儲存RBCs輸注誘導肝損傷的增加。新鮮RBCs輸注的小鼠中ALT和AST的血清水平增加，但與儲存RBCs輸注的小鼠相比顯著降低。儲存3 d的RBCs血清ALT和AST水平與儲存7 d的差異無統計學意義。在輸血后輸注CPDA-1早期和晚期的ALT和AST水平的差異無統計學意義。在膿毒血癥開始和之后輸血的ALT和AST的差異無統計學意義(圖6)。肝切片的組織學檢查顯示一致的結果，新鮮RBCs輸注的小鼠肝僅觀察到肝小葉結構完整，肝束排列整齊，肝竇狹窄，肝細胞可見輕度退行性改變，其中胞核空泡變性明顯，部分可偶見灶性壞死及炎細胞浸潤。而儲存RBCs輸注的小鼠肝顯示出大量壞死，肝竇狹窄，肝細胞可見輕度退行性改變，部分可見灶性壞死及炎性細胞浸潤，星星細胞反應性增生明顯。本研究結果表明，儲存RBCs的輸注增強銅綠假單胞菌誘導的體內肝損傷，并且肝損傷加劇膿毒血癥的嚴重性。

一項回顧性研究報道，對RBCs長期儲存(長達42 d)后的輸血效力和安全性方面進行了探索，結果表明，與輸入“新鮮”RBCs(例如少于14 d的儲存期)相比，輸注“老”RBCs(例如儲存期大于28 d)與多種并發癥相關，包括膿毒血癥、肺炎、多器官功能衰竭、心肌梗死、急性腎功能衰竭、血栓形成和病死率增加[4-5]。輸血患者的臨床結果受到血液儲存持續時間的影響。因此，儲存RBCs輸注后的作用存在一定的不確定性，在輸注時應權衡其利與弊。雖然通過血液到達肝臟的大多數病原體被局部的先天性和獲得性免疫應答消除或控制，但一些病原體可逃避免疫控制并持續存在于肝細胞中。病原體和宿主因素之間相互作用，促進病原體消除和維持器官完整性或允許病原體持久存在，從而導致發病率和病死率持續上升[6-7]。肝臟受到的損害從活動性肝細胞功能障礙發展到肝損傷，進展為肝衰竭。減少肝損傷及恢復肝功能可降低膿毒血癥患者的發病率和病死率。在膿毒血癥開始前或開始后的肝損傷對膿毒血癥患者的嚴重程度及轉歸發揮了重要的作用[8-10]。

有研究表明，膿毒血癥后肝臟功能異常是引起膿毒血癥患者死亡的獨立危險因素，在膿毒血癥中，肝臟因病原體、毒素或炎癥介質而受損。肝功能障礙是指肝細胞功能的輕微改變，例如合成降低或清除功能降低，肝損傷定義為對肝細胞的不可逆損傷，肝衰竭被定義為持續、嚴重的肝損傷和80%～90%的肝細胞功能喪失，肝損傷通過臨床檢查和實驗室測定難以量化。肝功能障礙常發生于早期膿毒血癥，動物通常在盲腸結扎和穿刺后1.5 h，臨床患者在膿毒血癥診斷當天(疾病發病后＜24 h)由于炎癥和灌注不足而發生肝功能障礙[11-13]。經過炎癥和低灌注的過程可導致肝損傷和肝衰竭。膿毒血癥引起的肝臟損傷由于肝細胞凋亡、壞死和嗜中性粒細胞積聚，可發生分子、生化和生理變化，病灶部位出現門靜脈炎、中心小葉壞死、小葉炎癥、肝細胞凋亡、膽管炎、脂肪變性、膽汁淤積和肝細胞損傷。急性肝損傷在嚴重膿毒血癥中很常見，可增加死亡的風險。肝功能異常或肝衰竭的膿毒血癥患者的病死率為54%～68%，高于呼吸系統功能異常或衰竭(膿毒血癥最常見的器官衰竭)的膿毒血癥患者[14-16]。減少肝損傷及恢復肝功能可降低膿毒血癥患者的發病率和病死率。

闡明儲存RBCs輸注引起的對膿毒血癥的炎癥性致病作用機制，尤其是其致肝損傷的機制，對于預防儲存RBCs引發的這一不良效應具有重要意義，因此，本研究將繼續探索輸注儲存RBCs后加重細菌感染并促進肝損傷的作用機制。