血培養(yǎng)奧默柯達(dá)酵母鑒定方法學(xué)比較及藥物敏感性

周夢蘭，于淑穎，肖 盟，徐英春

近年來，侵襲性真菌病（IFD）的發(fā)病率不斷增高，逐漸成為導(dǎo)致住院患者高發(fā)病率和病死率的重要原因之一，給患者的預(yù)后和生命安全帶來很大的威脅[1-2]。真菌血癥已成為醫(yī)院感染性疾病的第四大病因，總體病死率高達(dá) 40%，而且大大增加醫(yī)療支出[3-5]。盡管白念珠菌（Candida albicans）依然是引起IFD的主要病原菌，但是近年來IFD中非白念株菌如近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、熱帶念珠菌（Candida tropicalis）及其他少見酵母如奧默柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri）等的檢出率也在逐漸增高[6-7]。

本研究基于CHIF-NET監(jiān)測數(shù)據(jù)，對2010－2016年7年間血培養(yǎng)分離的奧默柯達(dá)酵母的流行病學(xué)數(shù)據(jù)及藥物敏感性進(jìn)行分析總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選取我國多中心侵襲性真菌監(jiān)測項目CHIFNET 2010－2016年連續(xù)7年收集的奧默柯達(dá)酵母，在中心實驗室進(jìn)行復(fù)核鑒定及藥物敏感性檢測，對其流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)核鑒定 所有菌株均在沙保弱培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇、傳代及分純。菌株鑒定以26S rDNA測序為金標(biāo)準(zhǔn)[8]，分別評估了法國生物梅里埃公司的VITEK 2-Compact、VITEK MS和德國布魯克公司Bruker MS的鑒定性能。對Bruker MS，本課題還同時進(jìn)行了直接涂布法和甲酸-乙醇蛋白提取法兩種前處理方法結(jié)果的比較。質(zhì)譜鑒定具體操作遵照儀器使用說明。VITEK MS判定標(biāo)準(zhǔn)：可信度為綠色方框（可信度60.0%～99.9%）的為鑒定至種水平，黃色三角的為低分辨率，紅色圓圈的為無鑒定結(jié)果。Bruker MS判定標(biāo)準(zhǔn)：鑒定分值≥2.0為鑒定至種水平，1.7≤鑒定分值＜2.0為鑒定至屬水平，鑒定分值＜1.7的為無準(zhǔn)確鑒定結(jié) 果。

1.2.2 菌株原始鑒定 基于復(fù)核鑒定結(jié)果，對所有奧默柯達(dá)酵母的原始鑒定結(jié)果進(jìn)行回顧性分析、總結(jié)。各參加單位所使用的原始鑒定方法主要包括VITEK 2-Compact、VITEK MS、ATB 32C、APC 20C以及CHROM agar顯色平皿。

1.2.3 抗真菌藥物敏感性檢測 參照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)，采用標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法（BMD）檢測8 種常用抗真菌藥物：氟康唑（0.25～256 mg/ L）、伏立康唑（0.015～16 mg/L）、伊曲康唑（0.015～16 mg/ L）、泊.康 唑（0.015～16 mg/ L）、.泊.凈（0.008～8 mg/ L）、.卡.凈（0.008～8 mg/ L）、5-.胞.啶（0.064～64 mg/ L）、.性.素B（0.015～16 mg/ L）的最低抑菌濃度（MIC）值[9]。抗真菌藥物標(biāo)準(zhǔn)粉均購自中國食品藥品檢定研究 院。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2010－2016年，CHIF-NET監(jiān)測網(wǎng)共收集到34株來自全國12個省份16所醫(yī)院血培養(yǎng)陽性患者分離的非重復(fù)奧默柯達(dá)酵母。其中2016年分離19株，占所有菌株的55.9%。該菌感染患者中男20例，女14例，分別占58.8%和41.2%。患者分布科室中外科占47.1%（16/34），其次為內(nèi)科23.5%（8/34）、重癥監(jiān)護(hù)室14.7%（5/34）、兒科8.8%（3/34）、急診科2.9%（1/34）和器官移植科2.9%（1/34）。

2.2 26S rDNA復(fù)核鑒定及評估

34株奧默柯達(dá)酵母26S rDNA測序結(jié)果經(jīng)與GenBank比對，與標(biāo)準(zhǔn)株CBS 6722相似度達(dá)99% ～100%。三種表型鑒定方法比較結(jié)果顯示：VITEK 2-Compact及VITEK MS分別可將94.1%（32/34）和100%（32/32）的菌株鑒定到種水平。Bruker MS直接涂布法及甲酸-乙醇提取法的種水平鑒定率分別為8.8%（3/34）、97.1%（33/34），屬水平鑒定率分別為67.6%（23/34）、2.9%（1/34）。見表1。

2.3 26S rDNA復(fù)核鑒定和原始鑒定比較

34株經(jīng)26S rDNA復(fù)核鑒定為奧默柯達(dá)酵母與當(dāng)?shù)蒯t(yī)院的原始鑒定的結(jié)果比較見表2，原始鑒定結(jié)果中僅有58.8%（20/34）的菌株被當(dāng)?shù)蒯t(yī)院準(zhǔn)確鑒定為奧默柯達(dá)酵母。其余14株奧默柯達(dá)酵母被VITEK 2-Compact、APC 20C、ATB和CHROM agar顯色平皿錯誤地鑒定為白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等其他念珠菌種。

2.4 藥物敏感性

因目前CLSI/EUCAST均尚無奧默柯達(dá)酵母折點，故對BMD檢測8種抗真菌藥物的MIC50、MIC90及MIC范圍歸納于表3。由表可見，除氟康唑MIC90高達(dá)16 mg/L外，其余7種抗真菌藥物對奧默柯達(dá)酵母均呈現(xiàn)良好的體外抗菌活性，MIC90為0.25～1 mg/L。

表1 34株血培養(yǎng)陽性奧默柯達(dá)酵母VITEK 2-Compact、VITEK MS和Bruker Biotyper MS鑒定結(jié)果比較Table.Performance of VITEK 2-Compact，VITEK MS and Bruker Biotyper MS compared with ITS gene sequencing in identification of 34 Kodamaea ohmeri isolates from blood culture

3 討論

奧默柯達(dá)酵母，原名奧默畢赤酵母（Pichia ohmeri及Yamadazyma ohmeri），是一種產(chǎn)子囊孢子酵母，最初從腌制蔬菜或腐爛水果中分離到，因其發(fā)酵作用而廣泛應(yīng)用于食品加工產(chǎn)業(yè)[10]。奧默柯達(dá)酵母歸屬于柯達(dá)菌屬，除奧默柯達(dá)菌種外還包含其他4個種（K.anthrophila、K.kakaduensis、K.laetipori和K.nitidulidarum），據(jù)現(xiàn)有報道僅奧默柯達(dá)酵母對人類有致病性[10]。但奧默柯達(dá)酵母并不是臨床常見的致病菌，該菌于1984年首次在胸水標(biāo)本中分離到，在當(dāng)時被認(rèn)為是污染菌或是無害的定植菌。自從1998年首例報道奧默柯達(dá)酵母引起的菌血癥以來[11]，各種由奧默柯達(dá)酵母引起的IFD逐漸增多，包括膿毒癥或真菌血癥[12-13]、導(dǎo)管相關(guān)血流感染[14-15]、腹膜炎[16]、心內(nèi)膜炎等[17-18]，病死率較高。另有研究報道奧默柯達(dá)酵母在兒科病房引起暴發(fā)性醫(yī)院感染[19]。

本研究首次對多中心陽性血培養(yǎng)分離的奧默柯達(dá)酵母進(jìn)行菌種復(fù)核鑒定和抗真菌藥物敏感性數(shù)據(jù)分析總結(jié)。質(zhì)譜作為新興的快速病原菌鑒定方法，在臨床微生物實驗室得到廣泛的使用。但由于奧默柯達(dá)酵母目前仍然分離較少，現(xiàn)有研究仍主要集中于個案報道，菌株鑒定大多使用基因測序的方法進(jìn)行。目前僅有一篇文章報道顯示使用Burker MS甲酸-乙醇提取法對奧默柯達(dá)酵母進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[14]，因此本研究對多中心分離的奧默柯達(dá)酵母進(jìn)行了不同表型鑒定方法的性能比較。相比較而言，VITEK 2-Compact及VITEK MS對奧默柯達(dá)酵母的鑒定效果較好；而Burker MS因樣品前處理方法的不同鑒定效果相差較大，甲酸-乙醇提取法的鑒定效果遠(yuǎn)優(yōu)于直接涂布法。回顧當(dāng)?shù)蒯t(yī)院的原始鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，34株奧默柯達(dá)酵母中僅有20株被正確鑒定，正確率為58.8%（20/34）。有6株奧默柯達(dá)酵母分別被CHROM agar顯色平皿鑒定為白念珠菌（n=3）、熱帶念珠菌（n=2）、光滑念珠菌（n=1），顯示鑒定結(jié)果完全錯誤。因奧默柯達(dá)酵母菌落顏色隨孵育時間的延長會出現(xiàn)特征性粉色到藍(lán)色菌落變化，菌落顏色的完全轉(zhuǎn)換可能需要1周時間[20]。而CHROM agar顯色平皿主要通過平皿顏色變化判斷結(jié)果，因此判讀過早或過晚均會導(dǎo)致判斷失誤，同時本研究在使用CHROM agar顯色平皿進(jìn)行鑒定時可能需要持續(xù)進(jìn)行2～5 d菌落顏色變化觀察。與印度單中心血流分離的奧默柯達(dá)酵母研究類似，除氟康唑外，本研究中分離的奧默柯達(dá)酵母對其他7種抗真菌藥物呈現(xiàn)良好的體外活性，提示其體內(nèi)治療可能有效[21]。

表3 34株血培養(yǎng)陽性奧默柯達(dá)酵母體外抗真菌藥物敏感性Table.In vitro antifungal susceptibility of antifungal agents against 34 Kodamaea ohmeri isolates from blood culture

綜上，本研究顯示，在引起IFD的病原中，奧默柯達(dá)酵母相對罕見，但感染病例的增加提示我們必須對其引起重視，早期準(zhǔn)確快速鑒定及抗真菌藥物敏感性檢測對其感染治療至關(guān)重要。