不同性別PyMT自發性乳腺癌小鼠成瘤特點和不同時間肺轉移觀察

郎佳麗金璐邵霞曹貝貝嚴楷蕾傅惠英壽旗揚

1.浙江中醫藥大學藥學院 杭州 310053 2.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院 3.湖州市中心醫院

在女性癌癥發病率中，乳腺癌的發病率是首屈一指的[1]。雖然治愈率較高，但仍是重要的致死因素。因此如何進一步研究乳腺癌靶向藥物、藥物作用的機理及相應的臨床治療手段日益受到廣泛重視[2]。在研究乳腺癌的發病機制、生物學特征、藥物及治療方法中，乳腺癌動物模型功不可沒。在生物學、病理學和組織學上越貼近人乳腺癌指標的動物模型，提供的實驗結果越是客觀準確[3-4]，其應用范圍就越廣泛[5]。

目前已建立了多種乳腺癌模型，如誘發性、移植性、自發性以及乳腺癌轉基因實驗動物模型[6]。但誘發性和移植性乳腺癌模型在實驗過程中具有明顯的缺點：誘導乳腺腫瘤模型其乳腺癌性質和發病程度受脂肪消耗的影響，同時存在建模耗時長、癌癥發生率不高及轉移性低等多種弊端[7-9]。相比之下，以小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子（mouse mammary tumor virus,MMTV）控制下表達多瘤中間T抗原（polyoma middle T-antigen,PyMT）的轉基因自發性乳腺癌小鼠具有與人體腫瘤病理相似、試驗周期短、癌癥自發率良好、成瘤時間短和試驗現象明顯[10-12]等客觀優點而被選為研究乳腺癌的經典模型。故本實驗采用MMTV-PyMT乳腺癌轉基因小鼠為研究對象來觀察在完整生命周期內不同性別、不同周齡下的癌癥發展過程與病理變化指標，以研究該模型的客觀規律，為乳腺癌藥物篩選及治療方法更新提供研究思路。

1 材料

1.1 實驗動物 MMTV-PyMT轉基因小鼠購自美國Jackson實驗室，品系名為FVB/N-Tg(MMTV-Py VT)634Mul/J。保種培育后，選取SPF級雌性PyMT小鼠10只，雄性PyMT小鼠5只，雌性FVB小鼠5只，共20只（15雌，5雄），均為8周齡，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障實驗室[（浙）2013-0184]；環境溫度：（22±1）℃；相對濕度 50%～60%；光照 12小時明暗交替；噪音：＜50dB；小鼠飼養于IVC中，自由飲食；在實驗過程中遵循3R原則給予實驗動物人道主義關懷。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 Bayer2120全自動血液細胞分析儀（德國西門子公司），PCR儀（美國Bio-Rad伯樂），Tanon-2500全自動數碼凝膠圖像分析儀（上海天能科技有限公司），ASP200S全自動脫水機、半自動切片機（德國Leica公司），AP280-2包埋機（德國MICROM公司），NanoZoomer 2．0 RS數字切片掃描儀（日本濱松光子公司）。

1.2.2 主要試劑 Taq 酶、dNTP Mixture、MgCl2、5×buffer、DNA marker、6×loading buffer等均購自 Takara公司，Biowest瓊脂糖粉購自北京艾普立邦科技有限公司，Gelreg凝膠核酸染料購自美國BIOTIUM公司。

1.3 方法

1.3.1 保種及擴群 從Jackson實驗室購買的乳腺癌MMTV-PyMT轉基因雄性小鼠即轉基因PyMT小鼠(+)與正常雌性小鼠FVB(-)合籠配種，通常1：2比例雜交。子代剪尾提取DNA，提取小鼠DNA后，進行PCR擴增，引物序列分別為：5'-CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG-3'：5'-gTC AGTCGA GTG CAC AGT TT-3'：5'-GGA AGC AAG TACTTC ACA AGG g-3'：5'-GGA AAG TCA CTA GGAGCA GGG-3'。反應條件為：94℃變性 2min；94℃ 20s,64℃ 1min,72℃ 1min,35個循環；72℃ 2min充分延伸，擴增產物為556bp。基因型鑒定后，選取雄性PyMT小鼠與雌性FVB小鼠全同胞兄妹交配，進行擴群，繼續通過以上鑒定方法篩選實驗小鼠。

1.3.2 一般觀察 每天觀察雄性與雌性PyMT小鼠的腫瘤是否長出，記錄腫瘤發病時間；每周記錄體重變化，并用小鼠游標卡尺測量腫瘤大小，觀察腫瘤生長趨勢、特征的變化。瘤體積計算：V=（長徑×短徑2）/2。

1.3.3 雄性與雌性小鼠生存率及生存時間比較 每天觀察雄性與雌性PyMT小鼠的精神狀態與腫瘤生長情況，且觀察是否有死亡情況并記錄其自然死亡時間。

1.3.4 血常規檢測 觀察雌性MMTV-PyMT小鼠腫瘤生長8周后，利用CO2實行安樂死。心臟取適量血液于2ml抗凝管中，血常規檢測42項指標，對其中以下7項指標進行比較：白細胞（white blood cell,WBC）、淋巴細胞（lymphcyte,LYMPH）、嗜酸性粒細胞（eosinophils,EOS）、嗜堿性粒細胞（basophil granule,BASO）、中性粒細胞（granulocyte,NUET）、單核細胞（monocyte,MONO）和未染色大細胞（large unstained cell,LUC）數量。

1.3.5 病理檢測 PyMT雌性小鼠與FVB雌性小鼠分別觀察4周、8周后，取完整肺觀察拍照，保存于10%甲醛溶液中，過夜固定，48h后取材，進行常規的脫水包埋后，用石蠟切片機將蠟塊切成4μm的薄片，進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，用NanoZoomer數字切片掃描儀對切片進行成像掃描，并用NDP．view軟件分析其病理變化。

1.4 統計學方法 所有數據以平均數±標準誤(±standard errors of mean,SEM)表示，用 SPSS 22．0 軟件進行統計分析，兩樣本間采用t檢驗，以P＜0．05表示差異具有統計學意義，P＜0．001表示差異具有高度統計學意義。

2 結果

2.1 MMTV-PyMT轉基因小鼠基因型鑒定圖 經聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）擴增后，加入 2μL 6×loading buffer，混勻，上樣 10μL 于1．5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，電泳30min后，結果如圖1中所示，MMTV-PyMT陽性小鼠基因檢測條帶為556bp，由此推斷樣本2、4和9均為MMTV-PyMT陽性小鼠，樣本 1、3、4、5、6、7、8 和 10 無條帶，為MMTVPyMT陰性小鼠即FVB小鼠。

2.2 雌性與雄性鼠腫瘤生長趨勢比較 如圖2B、2D中所示，乳腺癌MMTV-PyMT轉基因小鼠無論雌雄均會自發性出現腫瘤。雌性小鼠組在第8周出現可捫及的腫瘤，雄性組則在第18周出現可捫及的腫瘤，雌性小鼠出現腫瘤時間遠早于雄性小鼠，且雌性小鼠模型組腫瘤發展速度較雄性鼠快。隨著時間的推移，腫瘤的體積逐漸增大，數目增多。如圖2A、2C所示，兩組體重均呈現穩定增長的趨勢。

圖1 MMTV-PyMT轉基因小鼠基因型鑒定圖Fig．1 Genotypic identification of MMTV-PyMT mice

圖2 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠腫瘤生長情況與體重變化Fig．2 Changes of tumor growth and body weight of MMTV-PyMT mice

2.3 雌性與雄性鼠生存率及生存時間比較 如圖3所示，在觀察雄性與雌性小鼠生存率和生存時間的實驗中，雌鼠最早死亡發生在16周，于第20周全部死亡，而雄鼠組最早死亡發生在38周，于第46周全部死亡。

2.4 雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規指標比較 在雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規指標比較中，如圖4A中所示，雌性PyMT的 WBC數量明顯高于FVB小鼠，差異有統計學意義（P＜0．001）。白細胞分類中，如圖4B、4C、4F、4G中所示，PyMT小鼠的 NUET、LYMPH、BASO及 LUC數量均明顯高于FVB 小鼠，差異有統計學意義（P＜0．001）。如圖 4E、4D中所示，PyMT小鼠的EOS也顯著高于FVB小鼠，差異有統計學意義（P＜0．05），而 PyMT 小鼠的 MONO 數量高于FVB小鼠，但差異無統計學意義（P＞0．05）。

圖3 雌性與雄性鼠生存時間比較Fig．3 Comparison of survival time between female and male mice

圖4 雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規指標比較Fig．4 Comparison of blood routine indexes between MMTV-PyMT and FVB of female mice

2.5 腫瘤肺轉移情況 如圖5所示，FVB小鼠肺部表面平整邊緣光滑，顏色淡紅色無異常充血；PyMT小鼠16周時肺部表面出現若干卵石狀分布且充血暗紅的瘤體，說明該小鼠肺部出現嚴重的腫瘤轉移。

如圖6所示，肺HE染色結果顯示PyMT小鼠12周齡時肺泡結構部分被破壞，肺組織中大量炎癥細胞浸潤，氣管璧增厚，某些小鼠開始出現肺轉移。PyMT小鼠16周齡時肺組織出現嚴重的肺轉移，出現彌漫性分布，大小不等、質實、染色深的癌巢，呈非典型增生，導管受壓變窄，細胞間推擠或重疊，細胞大小形態不同，偶爾可見核分裂現象；腫瘤細胞排列紊亂，失去正常的結構和層次，胞核增大，核分裂增多。

3 討論

在小鼠乳腺癌病毒（mouse mammary tumor virus,MMTV）的轉錄控制下，特異性表達活化的neu酪氨酸激酶長鏈重復（long terminal repeat,LTR），形成于整個乳腺上皮細胞有關的腺癌[15]。影響neu酪氨酸激酶活性的另一因素是多瘤病毒（polyoma virus,PyV）中的T抗原。新生小鼠感染PyV會導致大量上皮細胞和間質腫瘤的形成，其中乳腺癌占據相當大比例。將上述兩個基因融合整合到小鼠的基因組中，即為乳腺癌MMTV-PyMT轉基因小鼠的建立[16]。乳腺上皮中PyMT中T癌基因轉化特性的分析提供了對惡性進展過程的重要啟示。在四種獨立的MMTV/中T轉基因小鼠中，轉基因的表達最終導致了乳腺上皮的形態轉化，進一步證實了乳腺中T抗原的潛在致癌潛力。

圖5 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肺部觀察（100×）Fig．5 Observation of lung tissue in MMTV-PyMT mice(100×)

圖6 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肺組織HE染色圖（100×）Fig．6 HE staining of lung tissue in MMTV-PyMT mice（100×）

本實驗在乳腺癌MMTV-PyMT轉基因小鼠完整生命期中，系統地觀察記錄腫瘤的發生、發展和轉移。雌性PyMT小鼠約在第8周開始出現可測量的腫瘤，隨著小鼠周齡的增加，小鼠體重逐漸增大，同時小鼠的瘤數目與瘤體積同樣呈現出上升的趨勢，且實驗結果顯示15周時瘤鼠開始出現死亡，到20周小鼠全部死亡。而雄性鼠約在第18周開始出現可測量的腫瘤，比雌性鼠發病時間晚，生存時間長，導致實驗周期長，因此較雄性PyMT小鼠而言，雌性PyMT小鼠是研究乳腺癌發展及轉移良好的動物模型。

白細胞分為顆粒細胞與無顆粒細胞，顆粒細胞包括中性粒細胞、嗜酸性細胞及嗜堿性細胞，無顆粒細胞包括單核細胞與淋巴細胞。中性粒細胞與巨噬細胞是炎癥反應的主要驅動者。中性粒細胞除了釋放細胞因子和趨化因子，還能促進腫瘤生長和侵襲[17]。已有文獻證明乳腺癌組織中有嗜酸性粒細胞浸潤[18]。單核細胞釋放到組織中成為巨噬細胞，腫瘤相關巨噬細胞可使腫瘤細胞免受CD8+細胞殺傷[19]、維持免疫抑制微環境[20]、減少抗原遞呈和阻礙T細胞增殖[21]。淋巴細胞可識別腫瘤細胞表面抗原，其數量的增加或與腫瘤細胞入侵有關。本實驗血常規檢測中發現，雌性PyMT小鼠白細胞及亞群（除單核外）數量均明顯高于FVB小鼠，產生明顯的炎癥反應，導致這種結果的原因可能是腫瘤感染或者是腫瘤細胞不可控地分泌一些激素或者因子，促進白細胞的生成或抑制其凋亡等，但越來越多的實驗結果證實炎癥促進腫瘤的發生與轉移，腫瘤微環境可趨化募集巨噬細胞、粒細胞以及白細胞等[22-23]。

雌性PyMT小鼠12周齡及16周齡肺部病理切片也顯示在腫瘤細胞侵襲肺部時會募集大量的炎癥細胞浸潤肺部組織，其中雌鼠12周時腫瘤細胞入侵肺部，而16周時已檢測到發生明顯的肺轉移，有文獻報道11周左右開始出現肺轉移瘤，已有多篇文章報道此種自發性乳腺癌出現肺轉移現象[24-25]，與本實驗結果一致。

綜上所述，雖然乳腺癌MMTV-PyMT轉基因小鼠發病機制與人體的發病機制有所不同，但其自然的發病過程與人體相似，可從動物、細胞、分子等不同層面了解乳腺癌，是篩選抑制腫瘤細胞浸潤、轉移等藥物良好的乳腺癌模型。在多方面可為臨床研究乳腺癌的發病機理提供思路，同時在預防、治療乳腺癌疾病上有一定參考意義。本研究與其他文獻不同之處在于從乳腺癌模型實驗動物性別選擇的角度出發，乳腺癌MMTV-PyMT轉基因雌性小鼠相較于雄性小鼠發病早、轉移快、生存周期短，有利于節省實驗時間及物資，大力度篩選高效抗腫瘤藥物，同時也減少了乳腺癌自發性模型腫瘤發生、轉移、死亡等關鍵時間點的偏差。此外，乳腺癌MMTV-PyMT轉基因雌性小鼠和普通FVB小鼠比較，血液中白細胞總數及白細胞各個不同分類細胞數量均有上升，說明腫瘤與炎癥反應密不可分；比較乳腺癌MMTV-PyMT轉基因雌性小鼠12周齡及16周齡肺部病理結果，也可以觀察到在腫瘤細胞侵襲肺部組織時產生的炎癥反應，為該模型腫瘤發生及肺轉移觀察提供參考。