野生草莓種子高效萌發體系及離體再生體系的建立

趙映潔　徐煒　白本文　段可　朱開才

摘 要 以野生草莓YW種子及其無菌苗葉片為試驗材料，分別建立野生草莓種子高效萌發體系及葉片離體再生體系。結果表明：通過隔夜浸泡，旋渦振蕩儀清洗草莓種子，并用5%NaClO消毒5 min，春化7 d，草莓種子萌發率高達73%;葉片最適不定芽誘導植物生長調節劑配比為IBA 0.1 mg·L-1+6-BA 3.4 mg·L-1。

關鍵詞 野生草莓種子;高效萌發;離體再生

中圖分類號：S668.4 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.21.001

草莓（Fragaria×ananassa Duchesne）屬薔薇科、草莓屬多年生草本植物，是十分美味的水果之一[1]。全世界草莓屬約24個種，主要分布在亞洲、歐洲和美洲[2]。我國地域遼闊，氣候類型多樣，有著豐富的草莓資源，是世界上野生草莓種類最豐富的國家[3]。野生草莓具有廣泛的適應性和多種優良特性，有些野生草莓在風味、品質、抗病蟲害等方面表現突出，可以作為改良栽培草莓的重要材料[4]。但國內有關草莓離體再生的報道大多都為栽培草莓，野生草莓離體再生的研究在國內報道較少[5-9]。基于此，以野生草莓Yellow Wonder（YW）為試驗材料建立高效的無菌種子萌發體系及葉片離體再生體系，為提高栽培草莓的品質和抗病蟲害能力等良種培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

飽滿有活力的YW種子。

1.1.2 培養基及培養條件

種子萌發培養基及不定芽誘導培養基均添加7 g·L-1的瓊脂，pH為5.7～5.8，121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min備用。

除暗培養外，所有試驗材料的培養條件均為16 h（光）/8 h（暗），光強2 000～3 000 lx，溫度23～25 ℃。

1.1.3 試劑

1/2MS、MS、IBA、6-BA、瓊脂、蔗糖等，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 YW種子消毒處理

YW種子浸泡過夜，隔天用旋渦振蕩儀清洗，用剪過的1 mL槍頭吸掉雜質及癟種，直至上清液完全澄清;分別使用3% NaClO、4% NaClO、5% NaClO消毒5 min，期間用旋渦振蕩儀低速振蕩;立即吸掉消毒液，無菌水清洗6～8次，然后吸打在1/2MS平板上，晾干水分后封口;每個處理3個重復，4 ℃春化7 d，報紙遮光處理21 d后統計萌發率及污染率。

1.2.2 YW不定芽誘導

選取YW葉齡及生長狀態一致的繼代組培苗葉片，去掉葉緣，剪成0.3～0.5 cm2的小塊，正面朝下置于6-BA濃度梯度為3.0 mg·L-1、3.4 mg·L-1、3.8 mg·L-1的培養基上進行處理，每個處理3個重復，30 d統計愈傷，60 d統計不定芽。

1.2.3 數據分析

用SPSS.17.0進行統計分析，WPS11.1進行作圖。

種子萌發率（%）=發芽種子粒數/萌發種子總粒數×100%

污染率（%）=污染外植體數/接種外植體總數×100%

0級愈傷發生率（%）=0級愈傷發生外植體數/總接種外植體數×100%（1～4級愈傷發生率類推）

分化率（%）=出芽的外植體數/接種外植體總數×100%

根據愈傷發生面積將其分為0～4五個等級，如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 消毒液濃度確定

圖2結果表明，隨著NaClO濃度的升高，種子萌發率先升高后降低，最高可達90%。而污染率隨著NaClO濃度的升高而降低，當NaClO濃度達到5%時，污染率降到了0%，種子萌發率可達73%。

2.2 6-BA對YW葉片再生的影響

如圖3所示，用6-BA誘導愈傷組織的分化，當6-BA濃度達到3.4 mg·L-1時，YW的3級、4級愈傷相比3.0 mg·L-1

6-BA顯著增加，分別為44.0%和20.0%，且在該濃度下愈傷生長狀態良好。當6-BA濃度達到3.8 mg·L-1時，0級、1級愈傷均降至2.3%，4級愈傷增至34.1%。

圖4表明，YW在6-BA濃度達到3.4 mg·L-1時，相比其他兩個濃度不定芽分化率最高，達26.4%。

3 小結與討論

草莓種子小、種皮厚、吸水透氣性差且種子內存在抑制物，導致種子發芽率極低，嚴重限制了草莓新品種雜交選育進程[7]?；诖耍ㄟ^消毒前浸泡種子，用旋渦振蕩儀創傷種皮的方法提高了消毒處理后草莓種子的萌發率，并得出了最佳的消毒條件：5%NaClO處理5 min。在該條件下消毒種子后春化7 d，種子萌發率可達73%，高于李文硯等[8]試驗中的70%。

有研究發現，在草莓葉片離體再生試驗中，細胞分裂素濃度高時會抑制不定芽的形成，促進愈傷組織的生長[9]。通過以上研究，發現隨著6-BA濃度的不斷升高，YW的愈傷再生率逐漸增大，當達到一定濃度時，愈傷誘導率可達100%，但不定芽誘導率卻隨著細胞分裂素濃度的增大呈現出先增大后降低的趨勢，這與前人研究結果一致。因此，葉片最適不定芽誘導植物生長調節劑的配比為：IBA 0.1 mg·L-1+6-BA 3.4 mg·L-1，不定芽發生率為26.4%。

參考文獻：

[1] Johnson AL， Govindarajulu R， Ashman TL. Bioclimatic evaluation of geographical range in Fragaria （Rosaceae）： consequences of variation in breeding system， ploidy and species age[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，2014，176（1）：99-114.

[2] 雷家軍，薛莉，代漢萍，等.世界草莓屬（Fragaria）植物的種類與分布[A].中國園藝學會：草莓研究進展（IV）[C].2015.

[3] 雷家軍，代漢萍，譚昌華，等.中國草莓屬（Fragaria）植物的分類研究[J].園藝學報，2006（1）：1-5.

[4] 馬鴻翔，陳佩度.草莓屬低倍性野生資源在育種中利用的研究進展[J].果樹學報，2003，20（4）：305-309.

[5] 周宇，張志宏，劉月學，等.野生二倍體草莓葉片離體再生及四倍體誘導[J].江蘇農業科學，2010（3）：44-46.

[6] 孫立茹，劉月學，孟楠，等.野生草莓EMC離體快繁和葉片再生的研究[J].山東農業科學，2009（4）：9-12.

[7] 梁中午，龐曉倩，馮彩蓮，等.3種浸種方法對草莓種子發芽率的影響[A].中國植物保護學會2018年學術年會論文集：綠色植保與鄉村振興[C].2018.

[8] 李文硯，孔方南，韋優，等.草莓種子萌發成苗及高效離體再生體系的建立[J].西南農業學報，2016（10）：2463-2469.

[9] Landi L， Mezzetti B. TDZ， auxin and genotype effects on leaf organogenesis in Fragaria[J].Plant Cell Reports，2006，25（4）：281-288.

（責任編輯：趙中正）