生物學(xué)自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)探索

吳智華 劉虹

摘要：指出了自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)室是培養(yǎng)大學(xué)生技能、創(chuàng)新意識(shí)和開拓精神的良好方法。植物凝集素對(duì)動(dòng)物紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的一個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，以植物凝集素實(shí)驗(yàn)為例，探討了生物學(xué)自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)的整體實(shí)驗(yàn)流程及其效果。通過對(duì)比常規(guī)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)中存在的一些問題，提出了若干改進(jìn)措施，取得了較好的效果。

關(guān)鍵詞：自主設(shè)計(jì);植物凝集素;凝集效果

中圖分類號(hào)：Q71.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）17-0268-02

1引言

高等院校是培養(yǎng)高層次專業(yè)技術(shù)人才的主力軍。目前高等院校的實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)，例如生命科學(xué)領(lǐng)域，大多數(shù)都是在理論部分講解以后，根據(jù)理論講解內(nèi)容，安排一些基礎(chǔ)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)或綜合性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生大多通過固定的實(shí)驗(yàn)流程，在做完實(shí)驗(yàn)并驗(yàn)證基本結(jié)論后通過提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告而結(jié)束。這些實(shí)驗(yàn)對(duì)學(xué)生加強(qiáng)課程知識(shí)的理解有益，但是對(duì)于培養(yǎng)大學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新能力則稍顯不足。如今高等院校培養(yǎng)大學(xué)本科生的首要目標(biāo)和任務(wù)是培養(yǎng)復(fù)合應(yīng)用型人才，為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，就要加強(qiáng)對(duì)學(xué)生技能訓(xùn)練、創(chuàng)新意識(shí)培養(yǎng)和開拓精神的鍛煉，從理論到實(shí)踐、從所知向能用的飛躍是現(xiàn)階段高等教育人才培養(yǎng)改革的重要環(huán)節(jié)。自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)通過多學(xué)科理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的運(yùn)用，以培養(yǎng)本科生的創(chuàng)新能力為基本價(jià)值取向，來(lái)達(dá)到培養(yǎng)大學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能的目的。自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生具有一定的專業(yè)知識(shí)，通過訓(xùn)練來(lái)培養(yǎng)學(xué)生的研發(fā)能力，有意識(shí)地在實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)，為培養(yǎng)創(chuàng)新型人才服務(wù)。關(guān)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，作者多年以來(lái)一直努力探索一條提高當(dāng)代大學(xué)生創(chuàng)新型動(dòng)手能力的教學(xué)發(fā)展改革之路，提倡自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑疚囊约?xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中的植物凝集素實(shí)驗(yàn)為例，來(lái)探討生物學(xué)自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)的整體實(shí)驗(yàn)流程及其效果，以期提高學(xué)生分析問題與解決問題的能力，最終達(dá)到創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)的目標(biāo)。

凝集素（lectin）是一類含糖、并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì)，與糖的運(yùn)輸、儲(chǔ)存物質(zhì)的積累、細(xì)胞間的互作以及細(xì)胞分裂的調(diào)控有關(guān)。凝集素在細(xì)胞識(shí)別和黏著反應(yīng)中起重要作用，它使細(xì)胞凝集是因?yàn)樗c細(xì)胞表面的糖分子連接，凝集素有一個(gè)或多個(gè)同糖結(jié)合的位點(diǎn)，在細(xì)胞間形成“橋”的結(jié)果，加入與凝集素互補(bǔ)的糖可以抑制細(xì)胞發(fā)生凝集，凝集素與糖結(jié)合的活性及專一性決定其功能。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞都能夠合成和分泌凝集素，第一個(gè)植物凝集素是在蓖麻籽中發(fā)現(xiàn)的，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種不同的植物凝集素。大多數(shù)的植物的凝集素存在于儲(chǔ)藏器官中，作為一種氮源。例如，種子來(lái)源的凝集素主要分布在子葉、胚乳和胚軸中;非種子來(lái)源的凝集素在營(yíng)養(yǎng)器官如葉片、莖、莖皮、鱗莖、塊莖、球莖、根狀莖、根、果實(shí)、花、子房、韌皮部汁液和花蜜中均有;對(duì)某些植物而言，受到危害時(shí)，凝集素會(huì)作為一種防御蛋白發(fā)揮作用。

在通用的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，大多會(huì)把植物凝集素對(duì)紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)作為一個(gè)鍛煉學(xué)生的驗(yàn)證性或綜合性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)開設(shè)的目的是使學(xué)生學(xué)習(xí)研究細(xì)胞凝集反應(yīng)的方法，了解細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)的原因;培養(yǎng)學(xué)生自主獲取知識(shí)和初步從事科研工作的能力。通過多年的教學(xué)實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)更適宜于開設(shè)成為自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)過程種發(fā)現(xiàn)的若干問題對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，取得了較好的結(jié)果。對(duì)比以往的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，不同之處是學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程，對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)材料采用不同的處理，通過摸索最終獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行У劐憻拰W(xué)生的動(dòng)手能力和綜合素質(zhì)。

2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

日常生活中常見的植物例如馬鈴薯、韭菜、黃豆、花生、西紅柿等都含有植物凝集素。本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生提前一周自主查閱文獻(xiàn)，每人選用兩種不同的植物材料，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程，提前配制實(shí)驗(yàn)中所需的非常規(guī)試劑;然后統(tǒng)一在實(shí)驗(yàn)課堂上進(jìn)行操作，有不足之處及時(shí)調(diào)整、修改自己的實(shí)驗(yàn)方案，完成實(shí)驗(yàn)計(jì)劃;最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理與分析，并撰寫正式的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

3實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生對(duì)兩種植物材料，設(shè)計(jì)不同的方法例如離心、勻漿過濾或者鹽析、過飽和沉淀等獲得含有可溶性植物凝集素的溶液，然后統(tǒng)一用2%的兔血紅細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)?zāi)氐挠袩o(wú)，并比較不同植物凝集素對(duì)血細(xì)胞凝集效果的強(qiáng)弱。

常規(guī)試劑：生理鹽水;磷酸緩沖液;硫酸胺;2%的兔血紅細(xì)胞。

2%的兔血紅細(xì)胞的制備：以無(wú)菌方法抽取兔的靜脈血液（加肝素抗凝劑）用生理鹽水洗5次，每次2000r/min離心5min，最后按紅細(xì)胞體積加生理鹽水配成2%兔血紅細(xì)胞液。

4問題分析及其改進(jìn)

4.1紅細(xì)胞的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞的選擇存在兩個(gè)問題，首先，兔靜脈血的采集比較困難，第一次開設(shè)本實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，按照常規(guī)講義。選取體型較大的兔子，用一次性注射器抽取兔耳靜脈血，只能獲得少量的靜脈兔血，而且學(xué)生人數(shù)較多時(shí)需要兔子數(shù)量相應(yīng)增加，經(jīng)濟(jì)成本較大。其次，如果沒有動(dòng)物房，兔子活體抽血后還需要飼養(yǎng)，耗費(fèi)成本增加。經(jīng)學(xué)生自主性試驗(yàn)比較后，雞血紅細(xì)胞的效果比兔血紅細(xì)胞的凝集效果要好，且動(dòng)脈血與靜脈血區(qū)別不大，取雞頸大動(dòng)脈血液相對(duì)取兔靜脈血而言要容易得多，而且量大，例如100名學(xué)生實(shí)驗(yàn)規(guī)模的話，取一只雞的頸動(dòng)脈血足夠供試驗(yàn)用，采兔耳靜脈血至少需要3～4只兔子。因此，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)采用雞血紅細(xì)胞以后，紅細(xì)胞更容易提取且經(jīng)濟(jì)成本較低。

4.2生理鹽水與磷酸緩沖液

植物凝集素的提取視植物材料不同而方法各異，學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候可以多方查閱文獻(xiàn)資料并進(jìn)行比較試驗(yàn)，例如提取馬鈴薯凝集素的時(shí)候可以先將馬鈴薯3～4g剪碎研磨成勻漿，研磨時(shí)加入少量的磷酸緩沖液或者生理鹽水，研磨后加入勻漿體積20～30倍的磷酸緩沖液，浸泡約1h，浸出的粗提液中即含有大量馬鈴薯凝集素。常用的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中提取馬鈴薯凝集素的時(shí)候，提到的溶液均為磷酸緩沖液。經(jīng)學(xué)生自主性試驗(yàn)比較后發(fā)現(xiàn)，生理鹽水和磷酸緩沖液處理后得到的植物凝集素具有同等的效果，而生理鹽水相對(duì)于磷酸緩沖液而言，配制更為簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)。

4.3硫酸銨飽和度的理解

提取常見植物韭菜葉、西紅柿或者黃豆、花生的凝集素時(shí)，其實(shí)驗(yàn)步驟較馬鈴薯復(fù)雜，例如韭菜葉勻漿以后要先過濾取上清液，用鹽析法在上清液中加入硫酸銨至60%的飽和度，然后采用2000r/min或者5000r/min的轉(zhuǎn)速離心兩次，每次15～20min，最后檢測(cè)離心后沉淀中植物凝集的有無(wú)。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)學(xué)生普遍較難理解硫酸銨的飽和度。而一般實(shí)驗(yàn)教材中也沒有針對(duì)硫酸銨的飽和度作具體解釋，只是在教材中寫道提取3～5g韭菜葉并按照1：1（W：V）加入生理鹽水研磨過濾后5000r/min離心兩次，第一次離心后取上清液加硫酸銨至60%的飽和度（約1.8g）。實(shí)際上1.8g硫酸銨固體和60%的飽和度的關(guān)聯(lián)，學(xué)生往往不清楚。因此，換算解釋如下：鹽析法生物分離時(shí)一般采用硫酸銨，其分段鹽析效果比其他的鹽好，不容易引起蛋白質(zhì)變性，參照O℃和25℃兩個(gè)溫度下硫酸銨的飽和度計(jì)算表，查得初始硫酸銨濃度為零，終飽和度為60%時(shí)0℃和25℃兩個(gè)溫度下每1mL溶液中分別需要加人硫酸銨固體O：361g和0.39g，如果實(shí)驗(yàn)條件按照O'C的情況計(jì)算，3～5g韭菜研磨過濾后得到約3mL的濾液的話，那么加入的硫酸銨固體就約為1.8g。所以教材中這種籠統(tǒng)的寫法并不科學(xué)，其次溫度把握也不準(zhǔn)確，學(xué)生實(shí)驗(yàn)一般在室溫下（25℃）進(jìn)行。經(jīng)學(xué)生自主性探索不同實(shí)驗(yàn)條件后。建議步驟調(diào)整如下：稱取3～5g韭菜葉，按照1：1（W：V）加入生理鹽水研磨過濾后5000r/min離心兩次，每次15min，用量筒準(zhǔn)確量取第一次離心后的濾液，按照濾液體積與硫酸銨質(zhì)量比例1：0.39加入硫酸銨固體，然后進(jìn)行第二次離心。

4.4不同植物凝集素凝集效果的比較

學(xué)生在自主設(shè)計(jì)此次實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，往往選用的植物材料有馬鈴薯、韭菜葉、花生、黃豆、西紅柿等等。從整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，上述植物凝集素對(duì)2%的雞血紅細(xì)胞的凝集效果較好，其中馬鈴薯凝集素的提取方法最為簡(jiǎn)單，對(duì)雞血紅細(xì)胞的凝集效果最好，韭菜、花生次之，黃豆較差。當(dāng)然，不同植物凝集素對(duì)血紅細(xì)胞的凝集效果也和凝集素的提取方法密切相關(guān)，離心的轉(zhuǎn)速和離心的時(shí)間等都會(huì)影響最終的凝集效果。

5結(jié)語(yǔ)

植物凝集素對(duì)紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，以往教材多選用具體的植物材料例如馬鈴薯、韭菜葉、花生中的一種，安排驗(yàn)證性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程來(lái)開展實(shí)驗(yàn)。自我設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)則要求學(xué)生先獨(dú)立查閱文獻(xiàn)，選用至少2種以上的植物，自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案來(lái)提取不同植物的凝集素，驗(yàn)證和比較這些不同種類的凝集素對(duì)紅細(xì)胞的凝集效果。針對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題需要及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，最終完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)。不同的植物材料有不同的提取方法，材料的選取、溶液的制備、離心的轉(zhuǎn)速和離心的時(shí)間都需要通過不斷的實(shí)驗(yàn)探索，才能獲得最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)。整體一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，既鍛煉了大學(xué)生查閱科學(xué)文獻(xiàn)、獨(dú)立思考、科學(xué)性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力，又培養(yǎng)了他們的綜合動(dòng)手能力和創(chuàng)新思維意識(shí)。這是普通的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)所不具備的優(yōu)點(diǎn)，本文以植物凝集素自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)為例，探討了不同植物凝集素的提取方法，以及對(duì)動(dòng)物紅細(xì)胞凝集效果的比較，并對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的各種常見問題進(jìn)行了分析與改進(jìn)，理論聯(lián)系實(shí)際，有利于在今后的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中更好地推廣這一自主設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)，在掌握相關(guān)的理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，更好地開設(shè)這門實(shí)驗(yàn)課程。