蘇鐵葉枯病病原菌鑒定研究

林鈞

摘要：指出了在蘇鐵樹上發現了一種葉枯病害，導致大量蘇鐵葉干枯，為明確其致病菌，采集了蘇鐵葉枯病葉片數份，對病原茵進行了致病性測定、形態學和分子生物學鑒定。結果顯示：病原茵接種后能夠產生與采集樣本相同的痛害癥狀。確定其為致病菌;對病原茵進行形態學鑒定發現病原茵的分生孢子器、分生孢子的形態與擬莖點霉相同;通過分子生物學鑒定可知待測茵株rDNA-ITS的序列與GenBank中吸蟲疫苗的rDNA-ITS的序列同源性可這97%。根據該病原茵的形態學特點以及rDNA-ITS測序結果可知：蘇鐵葉枯病病原菌為嗜血桿茵。

關鍵詞：蘇鐵;葉枯病;病原茵;嗜血桿菌

中圖分類號：$763文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）17-0097-02

1引言

蘇鐵，俗稱“鐵樹”，具有很高的觀賞價值和人文價值，在世界上廣為栽培觀賞和利用。但近年來蘇鐵葉枯病病害嚴重，導致大量蘇鐵葉干枯，大大影響了蘇鐵的觀賞價值。該病癥狀是初發病時，蘇鐵葉尖或葉片上出現黃色斑點，病斑呈圓形狀凹陷，隨著病情發展，病斑顏色逐漸轉為黃褐色，嚴重時再由黃褐色發展為具有黑色小粒點的灰白色，該黑色小粒點就是病原菌的分生孢子器。筆者對蘇鐵的葉枯病進行了致病性測定、形態學和分子生物學鑒定，旨在找出其致病的病原菌，為蘇鐵葉的防治提供理論依據。

2材料與方法

2.1材料

在2015～2018年間，每年的5～8月，分別從福州植物園、華南植物園、仙湖植物園的蘇鐵園內采集發病的蘇鐵葉子數片。

2.2方法

2.2.1病原菌的分離純化

取滅菌培養皿于操作臺中，用無菌操作法向培養皿中加入1～2滴25%的乳酸，再倒入10～15mL的pda培養基，搖動使之呈平面。培養好平板培養基后，取發病的蘇鐵葉，用剪刀從病健交界處剪取典型的病斑小塊組織，將病變組織放在70%酒精中浸3～5s后移入0.1%升汞液進行表面消毒，再放入滅菌水中漂洗。完成后用無菌操作法將病變組織放人平板培養基中，每塊培養皿可放4～6塊，然后將培養皿置于恒溫箱內培養。之后使用稀釋分離法將較為整齊一致的菌落挑取出來進行斜面培養，多次進行分離純化直到獲得純種菌株。

2.2.2病原茵的致病性測定

取健康的蘇鐵葉片分為對照組和實驗組。用75%酒精對蘇鐵葉片進行表面消毒，使用刺傷法和無傷接種在實驗組葉片上接種3個接種點，接種分離純化后的5mm的菌餅，對照組葉片上接種2個接種點，接種5mm無菌的PSA培養基。將接種后的葉片放入培養皿中在25℃、光照1500Ix的培養箱中進行培養，觀察接種結果，將出現病斑的葉片進行組織分離，確定致病菌株。

2.2.3茵落的培養特征和形態學鑒定

在25℃、PSA平板上培養致病菌株數日，記錄菌株的培養特征。完成致病性測定后，用針尖將接種成功的葉片上的小黑點挑取出來置于玻片中，在光學顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態、大小。

2.2.4病原茵的分子生物學鑒定

取0.5g茵絲在加入石英砂的研缽中研磨至粉狀，加入已預熱至65℃的3mLDNA提取緩沖液，充分振蕩混勻后65℃水浴30min，之后加入1mL5MKAC，冰浴20min，取等體積的24：1的氯仿和異戊醇混合，在12000r/min、5℃下離心5min，再取上清液加入2/3體積的已預冷至-20℃異丙醇，混勻，靜置30rain。再用玻璃棒挑取出其中的絮狀沉淀，用75%的乙醇反復沖洗，再用無水乙醇漂洗，吹干后置于5L TE中，加入1uL的RNaseA于37℃處理1h，加入25：24：1的pH=8的苯酚、氯仿和異戊醇，在12000r/rain，4℃下離心，取上清加人1/10V 3M NaAc，2.5V體積的無水乙醇，在一70℃沉淀30min以上，取沉淀用75%無水乙醇沖洗，吹干后溶于200uL無菌水中，在-20℃下保存備用。

選用通用引物ITSl（5-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3）對提取得到的病原菌DNA進行擴增，擴增結束后，取5uL的擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在NCBI網站中將測出的ITS序列進行同源性分析，將分析得出的序列提交到GenBank，然后在其中選擇合適的序列，用CLUSTALW2.0軟件對比序列，同時使用MEGA5.05中的NJ構建系統發育樹。

3結果與分析

3.1病原菌的分離純化

經過分離純化，共獲得病原菌菌株20株，編號為A01-20。回接后發現其中的A05、A08、A11、A17均為非致病菌，其余菌株形態基本一致，后面進行病原菌的致病性測定和形態學鑒定使用A07菌株。

3.2病原菌的致病性測定結果

實驗組的葉片在接種2d后刺傷接種點出現褐色病斑且隨著時間推移擴散，第9d開始出現葉片干枯現象，13d后出現黑色的分生孢子器，15d后葉片完全變成褐色。將病害葉片上的病原菌進行分離培養，發現分離物的形態特點與實驗組接種的供試菌株形態特點相同，由此可知供試菌株即為蘇鐵葉枯病的致病菌。

3.3病原菌的形態學鑒定結果

光學顯微鏡下可觀察到分生孢子器大小約為255～425mm，有球狀和扁球狀。器壁為褐色，有孔口。壓迫后可出現甲型分生孢子，大小約為（5.11～10.4）ptm×（2.0～4.6）p.m，呈無色紡錘狀，其中有2～3個油球，未觀察到乙型分生孢子。分生孢子梗為無色，呈分隔狀或簇狀。

將菌株進行培養4d后，發現菌絲為白色絨毛狀、呈輻射狀生長;6d后菌絲的背面開始出現黑色小粒點;15d后正面出現黑色的分生孢子器;30d后正面的黑色小粒點噴出黃色的分生孢子。取黃色的分生孢子置于光學顯微鏡下觀察，除觀察到甲型分生孢子外，還有乙型分生孢子，大小約為（15.25～51.78）p.m×（0.7～1.25）um，為單胞、線性、無色且無油球的真菌。

3.4病原菌的rDNA-ITS測序結果

對病原菌的DNA進行擴增可得到一條600bp左右的條帶，測序目的片段長度為527bp，將測得的DNA序列與GenBank中的DNA序列進行同源性對比，發現菌株A07與GenBank中的Phomopsis vaccinii的同源性最高可達97%，而構建的系統發育樹中發現該病原菌與擬莖點霉菌株的遺傳距離最近，但該病原菌又不是Phomopsis vaccinii，由此可知該病原菌為Phomopsiscycacis。

4結論與討論

我國關于擬莖點霉引起的蘇鐵葉枯病的論文很少。本人通過對A07病原菌DNA的測序發現與擬莖點霉的Phomosis vaccinii的同源性最高，同時構建出的系統發育樹中顯示，Phomosis vaccinii和Phomosis cycadis支持率達98%，但是兩者的形態學特點具有很大的差異。根據對A07病原菌的形態學鑒定和培養特性顯示蘇鐵葉枯病病原菌的形態特點與Phomosis cycadis相似。因此可以鑒定蘇鐵葉枯病的致病菌為擬莖點霉Phomosis cycadis