基于網絡藥理學三芪口服液治療糖尿病腎病的作用機制

林嘉榮 張 蕾 桂定坤 曾貴興 吳禹池 鄒 川 林啟展

1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院腎內科，廣東廣州 510120；3.上海交通大學附屬第六人民醫院腎內科，上海 200233

據流行病學研究，我國慢性腎臟病發病率約10.8%[1]，而慢性腎臟病最終發展為腎終末期疾?。‥SRD），已經成為我國嚴重的公共衛生事業問題。在我國，糖尿病腎病作為繼慢性腎小球疾病之后慢性腎臟病的第二大病因[2]，且近年有升高趨勢。在西方國家，糖尿病腎病已成為導致ESRD 的第一大病因[3]。因此，防治糖尿病腎病的重要性不言而喻。國醫大師張琪教授認為，糖尿病腎病病機以本虛標實為特點，包含氣陰兩虛、脾腎氣虛，脾腎虛衰三個主證及夾血瘀、夾濕濁、晚期以濕濁毒瘀血壅結三個兼證[4]。張再康等[5]根據多年臨床經驗，認為糖尿病腎病氣虛血瘀病機貫穿病程始終，根據益氣活血理論防治糖尿病腎病的臨床實踐，以三七、黃芪為主要成分開發的三芪口服液取得了良好的臨床療效，但其機制尚不明確。目前針對中藥復方有效成分及作用機制主要通過動物實驗、細胞實驗等方法進行，但由于中藥復方活性成分復雜，其作用機制研究存在一定的困難。隨著科技的發展及化合物研究的興起，網絡藥理學為復雜的中藥系統研究提供了新的思路及方法。本研究運用網絡藥理學的方法，對三芪口服液的活性成分及作用靶點進行預測分析，探討其治療糖尿病腎病的作用機制，為三芪口服液的作用機制研究提供實驗基礎及理論研究。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMSP 數據庫、DrugBank 數據庫、String 數據庫、GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、DisGeNET 數據庫；DAVID 6.8 數據庫；KEGG 數據庫；Cytoscape 3.2.1 軟件。

1.2 藥物分子信息收集及活性成分篩選

在TCMSP 數據庫中檢索得到三七和黃芪的藥物動力學（ADME）參數信息，將生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選指標，其篩選閾值均為OB ≥30%，DL ≥0.18[6]，篩選出三芪口服液中的活性成分。

1.3 三芪口服液潛在作用靶點預測

基于篩選的活性成分預測化合物潛在的靶點，經DrugBank 數據庫將測出的靶點，以基因簡稱命名。

1.4 糖尿病腎病相關靶點構建

本研究基于GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、DisGeNET 數據庫構建糖尿病腎病的相關靶點。Gene-Cards 數據庫整合了約125 個網絡來源的基因數據（包括基因組、轉錄組學、蛋白質組學等）；OMIM 數據庫通過對新的病癥分類并命名、收錄表型和相關病因基因的關系來收錄人類孟德爾疾病信息；DisGeNET是目前可用的最大和最全面的人類基因-疾病協會（GDAs）存儲庫之一，旨在解決有關人類疾病遺傳基礎的各種問題。以“Diabetic nephropathy”為檢索詞，在三大數據庫中檢索其疾病相關基因。最后合并三大數據庫檢索到的基因靶點，剔除重復值取其并集，完成糖尿病腎病相關靶點的構建。Venny 2.1.0 工具可以將三大數據庫得到的疾病靶點與藥物作用的靶點進行篩選，從而得出兩者之間的重復靶點，即得出藥物治療疾病的靶點。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）全局網絡構建

將糖尿病腎病相關靶點與三芪口服液潛在靶點導入String 蛋白質互作數據庫，進行PPI 分析，利用Cytoscape3.2.1 構建靶點-靶點PPI 網絡。設置網絡中節點大小和顏色深淺反映度的大小，邊的粗細反映連接度的大小，通過構建這一網絡分析三芪口服液的作用機制。

1.6 潛在靶點生物學過程分析及通路富集

將三芪口服液-糖尿病腎病-基因數據集導入DAVID 6.8 數據庫進行GO 分析及KEGG 通路富集分析，從而得到基因的功能水平分析結果和共同通路。

2 結果

2.1 三七-黃芪活性成分的篩選

通過TCMSP 數據庫檢索的三七化學成分119 個，黃芪化學成分87 個，通過OB ≥30%和DL ≥0.18 進一步篩選到三七、黃芪潛在活性成分各為8 個和20 個，剔除重復成分1 個，共27 個。見表1。

2.2 三芪口服液治療糖尿病腎病的潛在作用靶點預測

利用DrugBank 數據庫，得到三七、黃芪活性成分靶點各為162 個和180 個，去除重復靶點后得三芪口服液活性成分靶點191 個。在GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、DisGeNET 數據庫共收集糖尿病腎病相關靶點基因共2423 個。利用Venny 2.1.0 工具將藥物潛在作用的靶點基因同疾病基因進行映射比對并繪制維恩圖（圖1），獲得共同基因118 個。

2.3 藥物-活性成分-關鍵作用靶點網絡構建與分析

將三七、黃芪兩味藥物共27 個活性成分及118 個關鍵靶點基因導入Cytoscape 軟件進行網絡構建及可視化，見圖2（封四）。其中連接度最高的化合物有槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、芒柄花素（formononetin）、異鼠李素（isorhamnetin）等；連接度最高的基因有PTGS2、PTGS1、ADRB2、PRSS1、AR、PPARG、ACHE、JUN、AKR1B1 等。

2.4 關鍵靶點基因蛋白質相互作用網絡分析

將三七-黃芪治療糖尿病腎病的118 個潛在的關鍵靶點基因導入String 數據庫獲取蛋白質相互作用關系，再將獲得數據導入Cytoscape 軟件繪制蛋白關系網絡（圖3）。以Degree 數值反映節點的大小，節點的Degree 數值越大，節點越大。以Combine score 反映節點連接之間邊的粗細，Combine score 越大，邊越粗。其中Degree 數值前5 名的靶點基因為JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6。表明這些基因在網絡中具有重要地位，這些靶點基因在三七-黃芪治療中具有重要意義，可作為三七-黃芪藥對有效成分作用的靶點基因。

2.5 關鍵靶點基因生物功能及通路分析

GO 分析結果顯示，三芪口服液的118 個潛在關鍵靶點基因的富集的前10 個生物學功能主要為蛋白質異二聚化活性、受體配體活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性、血紅素結合、磷酸酶結合、下游受體信號傳感器活動、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、激酶調節劑活性。表明三芪口服液通過參與調控多種生物學過程而發揮治療糖尿病腎病的作用。KEGG 通路富集分析顯示，三芪口服液的關鍵基因靶點主要富集的通路為糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路等。表明三芪口服液的活性成分通過各個通路對糖尿病腎病有治療作用。見圖4～5。

表1 三七與黃芪潛在活性成分

圖1 疾病靶點基因與三七-黃芪靶點基因的匹配

圖3 三芪口服液的蛋白質互相作用網絡

3 討論

圖4 三芪口服液治療糖尿病腎病關鍵靶點的GO 生物學過程富集分析

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發癥之一，是慢性腎臟病的第二大原發病。楊霓芝教授根據多年的臨床經驗，認為糖尿病的基本病機為氣虛血瘀證[7]。益氣活血法為治療糖尿病腎病的基本大法，應貫穿于糖尿病腎病治療的始終。根據這一理論，楊教授主持開發了廣東省院內制劑——三芪口服液，在臨床治療中收到了良好的療效[8]。動物實驗發現，三芪口服液可減輕實驗性糖尿病腎病模型大鼠蛋白尿及腎臟損害，改善脂質代謝，并且可以控制血糖和改善腎血流動力學，發揮腎臟保護作用[5，9]。在三芪口服液的初步藥理機制研究中發現，三芪口服液可能通過調節腎組織MMP-9/TIMP-1 蛋白表達，改善Col-Ⅳ代謝，以及抑制腎組織TGFβ-1 表達，發揮對糖尿病腎病的保護作用[10-11]。具體機制仍需進一步研究。

在三芪口服液的藥物-活性成分-基因靶點網絡中，活性成分槲皮素、山奈酚、芒柄花素、異鼠李素等是網絡中的重要節點。研究表明，槲皮素能通過抑制氧化應激改善腎功能不全及腎臟病理損傷[12-13]。山奈酚通過抑制細胞中高血糖誘導的RhoA 活化，降低氧化應激、促炎細胞因子（TNF-α 和IL-1β）和腎臟纖維化[14]。芒柄花素也證實了可以減輕腎臟損害，改善腎功能[15]。異鼠李素通過抑制NF-κB 信號通路發揮腎臟保護作用[16]。目前的相關研究均證實了三七與黃芪的活性成分對糖尿病腎病有治療作用，也說明了預測的合理性。而在重要的基因節點中，有研究發現，PPARG 是中國糖尿病腎病進展的風險[17]。在一項中國的前瞻性隊列研究[18]中發現，IL-6 基因多態性可作為中國2 型糖尿病患者腎病進展的預測因子，而另一項研究[19]表明，IL-6 基因增加1 型糖尿病腎病患者白蛋白與肌酐的增加以及不利于血糖、血脂控制。PTGS2、PTGS1、ADRB2、PRSS1、AR 等基因目前還未有明確的證據研究，或許可作為糖尿病腎病研究的新靶點。

GO 分析結果顯示，富集的關鍵基因靶點涉及的生物學過程細胞因子、受體結合、RNA 聚合酶轉錄。KEGG 通路富集分析顯示，三芪口服液通過糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路等信號通路發揮對糖尿病腎病的治療作用。研究證實，AGERAGE 信號通路是糖尿病及其并發癥發病機制中的信號傳導機制[20]，通過氧化應激加重糖尿病血管損傷[21]，增加腎功能惡化及心血管事件風險，導致全因死亡率增加[22]。在一項病例對照及生物學分析的研究中發現，糖尿病腎病患者的PI3K/Akt、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、TGF-β1 和松弛素信號通路的基因的循環miRNA 表達上調[23]。許多研究表明[24-26]，IL-17 通過促炎性反應加重糖尿病腎病進展，而一項新的研究[27]卻發現，低劑量IL-17 療法可以預防和逆轉糖尿病腎病、代謝綜合征和相關器官纖維化，這可能是因為IL-17 對炎癥的調節作用依賴于疾病背景、組織、同種型和受體-配體相互作用[28]。缺氧誘導因子HIF-1 能介導缺氧和誘導糖尿病腎病纖維化[29]，但是開發脯氨酰羥化酶抑制劑以促進HIF 活性以治療腎性貧血也可能靶向糖尿病誘導的腎缺氧，需要進行進一步的臨床試驗驗證結果[30]。

總之，本研究運用網絡藥理學方法，探討了三芪口服液主要成分治療糖尿病腎病的復雜網絡關系及機制。研究結果表明三芪口服液主要活性成分、作用靶點、生物學過程及相關通路，為進一步研究其治療機制提供新思路，但其結果仍需進行相關基礎研究及相關研究進行驗證。