復方鉤藤降壓片干預高血壓左心室肥厚血漿代謝組學的通路分析

馮 宇 俞赟豐 周曼麗 王健章 張家齊 錢舒樂 簡維雄

湖南中醫藥大學中醫學院，湖南長沙 410208

復方鉤藤降壓片主要由鉤藤、麥冬、川芎等中藥組成。近年來，通過對復方鉤藤降壓片進行臨床及實驗研究[1-2]，證實其可抑制機體炎癥狀態，為其降壓機制提供了新依據。

本研究前期運用代謝組學技術[3]試從小分子代謝產物層面闡釋其作用機制。結果發現共有11 種代謝產物與復方鉤藤降壓片組相關：胞嘧啶核苷酸、腐胺、來蘇糖酸、二十四烷酸、甘油酸、肌醇、肌苷、山梨糖醇、木糖醇、核糖、乳酸。為從代謝途徑水平了解細胞或組織的生物學意義[4]，故進行下一步的KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）、HMDB（the hu man metabolome database）、MetaboAnalyst 數據庫等信息分析。具體內容如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級12 周齡自發性高血壓大鼠16 只，雄性，180～220 g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格許可編號：20141020，飼料購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養于湖南中醫藥大學實驗中心。

1.2 代謝譜來源

本研究前期實驗[3]顯示，復方鉤藤降壓片組和替米沙坦組的血漿代謝產物通過模式識別：復方鉤藤降壓片組與腐胺、胞嘧啶核苷酸、甘油酸、來蘇糖酸、二十四烷酸、肌醇、肌苷、木糖醇、山梨糖醇、核糖、乳酸有關。

1.3 分析軟件

通路分析采用KEGG（http：//www.genome.Jp/kegg/）、MetaboAnalyst 網絡軟件（http：//www.metaboanalyst.ca）分析代謝產物相關的酶、轉運蛋白和相關性質。

2 結果與分析

2.1 代謝組產物檢索匹配情況

有11 種代謝產物與復方鉤藤降壓片組有關，將其在KEGG 和HMDB 中進行檢索，相應的ID 號。見表1。

2.2 代謝產物路徑分析

MetaboAnalyst 分析后，生物代謝通路顯示，11 種代謝產物參與14 條代謝路徑，通路見表2、圖1。通過拓撲分析計算表中代謝通路的影響，選出P＜0.05 的2 條代謝路徑（磷酸戊糖路徑和嘌呤代謝）。圖2～4 顯示了具有較高影響值的2 條通路的詳細結構，結果顯示其內源性代謝物在實驗過程中有明顯波動，對左心室肥大有顯著影響。

表1 高血壓左心室肥大血漿代謝組產物基本注釋表

表2 通過MetPA 得到的獨特的通路分析結果

2.2.1 磷酸戊糖途徑 經葡萄糖-6-磷酸脫氫酶氧化后葡萄糖-6-磷酸形成6-磷酸葡萄糖內酯，6-磷酸葡糖酸通過6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶氧化脫羧形成核酮糖-5-磷酸。核酮糖-5-磷酸通過核酮糖-5-磷酸異構酶或核酮糖-5-磷酸差向異構酶分別生成核糖-5-磷酸或木酮糖-5-磷酸。核糖-5-磷酸通過核糖磷酸焦磷酸激酶產生核糖磷酸焦磷酸。7-磷酸在轉酮醇酶作用下生成核糖-5-磷酸。木酮糖-5-磷酸通過轉酮醇酶生成景天庚酮糖-7-磷酸和甘油醛-3-磷酸。甘油醛在乙醛脫氫酶作用下生成甘油酸，再在甘油2-激酶催化下產生2-磷酸甘油酯。見圖2。

2.2.2 嘌呤代謝 核糖-5-磷酸通過葡萄糖磷酸變位酶2的作用轉化為核糖-1-磷酸。磷酸戊糖焦磷酸激酶催化核糖-5-磷酸生成5-磷酸核糖-α-焦磷酸（PRPP）。5-磷酸核糖-1-焦磷酸在磷酸核苷酸胺轉移酶的作用下產生5-磷伯胺。見圖3。

2.2.3 嘌呤代謝 肌苷二磷酸通過外核苷三磷酸雙氫化酶產生肌苷。肌醇5’-四磷酸在酶的作用下產生肌苷。肌苷在三磷酸肌苷焦磷酸酶的作用下產生次黃嘌呤核苷酸（IMP）。見圖4。

3 討論

左心室肥厚（LVH）通常表現為室壁增厚、心肌重塑和心肌重量增加，是機體對長期增加的血液流動學負荷的一種適應性改變[5]。在復方鉤藤降壓片干預的動態過程中，11 種代謝產物對應于KEGG 中的共有14 條通路，其中2 條顯著富集，3 種蛋白質（核糖-5-磷酸、甘油酸、肌苷）參與了重要通路。

圖1 用MetPA 分析得到的通路分析概要圖

圖2 Pentose phosphate pathway 代謝通路的結構

圖3 Purine metabolism 代謝通路的結構局部放大圖

圖4 Purine metabolism 代謝通路的結構局部放大圖

磷酸戊糖路徑（Pentose phosphate pathway，PPP）是細胞內葡萄糖的代謝路徑之一，是DNA 和RNA 在體內合成戊糖的唯一來源[6-7]。有研究[8]表明，內皮中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺失會降低一氧化氮利用率以致內皮功能障礙。內皮功能障礙時，收縮因子與內皮舒張失衡，影響內皮素-1，它可通過各種信號轉導途徑，產生成纖維細胞，促進心肌肥厚及心肌纖維化[9-10]。實驗[11]證明NADPH 的減少會引起氧化應激，并損傷脂肪與蛋白質。其中氧化應激在研究中顯示參與了心肌重構生理病理過程[12]。川芎中主成分川芎嗪能改善炎性反應及氧化應激[13]，由此川芎可能干預此代謝通路阻止心肌重構發生。

在磷酸戊糖路徑（pentose phosphate pathway，PPP）中有核糖-5-磷酸（C00117）和甘油酸（C00258）參與。甘油醛在乙醛脫氫酶作用下生成甘油酸，其中在心肌梗死、缺血灌注等心肌損傷過程中乙醛脫氫酶可起到保護心肌的作用[3]。核糖-5-磷酸可用于核酸的生物合成。當心肌細胞脫氧核糖核酸與核糖核酸合成過多時，會使心肌細胞體積增大及肥厚引起左心室肥厚[14]。鉤藤中有效成分鉤藤堿能抑制血管平滑肌增殖、降低平滑肌張力[15]，改善心室結構。鉤藤可能在代謝通路中起作用，影響心室結構。

用于心肌嘌呤補救合成途徑的前體物質包括腺苷和肌苷。腺苷可通過腺苷激酶途徑合成ATP，以增加缺血心肌能量的保存。肌酐參與腺苷脫氨酶-嘌呤核苷磷酸化酶-磷酸核糖焦磷酸轉移酶系統，轉化為AMP，磷酸化的AMP 合成ATP 以增加心肌能量的物質儲存[16]。肌苷可抑制磷酸核糖焦磷酸（PRPP）在體內的活化，從而改善心肌的能量狀態，氧化導致的細胞損傷也可以得到緩解[17]。腺苷可從抑制ROS 的生成與中性粒細胞的活化、抗炎作用等多個方面進行心肌的保護[18]。麥冬也可減輕炎性反應[19-20]，促進心肌保護。

在嘌呤代謝通路中有肌苷（C00081）和核糖-5-磷酸（C00117）參與。肌苷可通過抑制核蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶阻止一氧化氮化酶，使一氧化氮（NO）的合成降低，保護細胞的膜性結構[21-22]。在心血管系統中，NO 的生物效應降低由自由基不平衡而引起，從而引起心肌纖維化與心肌細胞肥大等現象。在體內，次黃嘌呤核苷酸可產生類似于NO 供體的生物效應，以改善受損血管內皮的功能，提高心肌收縮力[23]。鉤藤中主要成分異鉤藤堿可有效抑制NO 釋放[24]，麥冬有效成分可保護血管內皮細胞[25]，都能促進膜性結構恢復。核糖激酶將核糖磷酸化，隨后磷酸化的核糖參與嘌呤代謝，核糖水平降低，可能與膜體結構的恢復引起腺苷酸激酶活性增加相關[26]。

通過通路分析構建的網絡圖，發現該藥物可能對通路中某些代謝產物或酶等進行特異性干預，從而恢復正常細胞結構，調節脂肪酸代謝等。且實驗研究[1，7]復方鉤藤降壓片相對于西藥，降壓效果更明顯。而復方鉤藤降壓片在干預左心室肥厚過程中，對通路中某些血漿代謝產物的作用仍需要通過實驗進一步生物學驗證。