定量DCE-MRI和QCT評價兔糖尿病模型骨髓微血管滲透性和骨小梁改變的相關性

陳翩翩，查云飛，2*

糖尿病骨髓脂肪生成增加、骨髓微血管病變等導致的骨髓和多器官功能障礙已引起廣泛關注[1]。糖尿病病人患骨折、退變及骨質疏松等骨病的風險明顯增加，且治療效果往往比同類疾病的非糖尿病患者更差[2-3]，顯示骨髓組織是糖尿病另一個重要的靶器官[4-5]。最新研究結果顯示骨髓微血管改變是糖尿病骨髓病變的重要特征[6]。Hu等[7]的實驗研究結果顯示動態對比增強磁共振成像(dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)灌注參數可以反映糖尿病早期骨髓通透性的改變，DCE-MRI 技術可以用評估脊柱骨髓微血管病變。定量計算機斷層掃描(quantitative computed tomography，QCT) QCT采用的是三維體積CT數據，測量的是真正的體積骨密度[8]，與其他投影技術(DXA等)測量的面積骨密度相比，QCT在糖尿病骨病評價中有其獨特的優勢。

糖尿病骨髓微血管病變、骨密度、骨結構、骨轉換及骨折風險評估的復雜關系尚待深入研究[2，9-10]。本研究旨在應用定量DCE-MR和QCT評價四氧嘧啶誘導兔糖尿病椎體骨髓微血管滲透性參數與骨密度和骨小梁形態計量學參數的相關性，探索QCT 能否反映早期兔糖尿病腰椎骨小梁微結構改變。

1 材料與方法

1.1 兔糖尿病模型的建立

本實驗經武漢大學人民醫院倫理委員會審查通過，由武漢大學動物實驗中心提供健康成年雄性日本大耳白兔24只，空腹體重2.8～3.1 kg，平均(3.0±0.1) kg。所有兔適應性飼養1周后進行造模，造模前均禁食不禁水12 h，測量空腹血糖，血糖值均＜6.0 mmol/L [(5.5±0.3) mmol/L]。隨機將兔分為實驗組14只、對照組10只。將四氧嘧啶(Sigma公司)用0.9%的生理鹽水配制成5%的溶液，按照100 mg/kg的劑量快速由耳緣靜脈注入實驗組兔體內，對照組則注入同等劑量的生理鹽水，之后自由進食、進水。48 h后，用血糖儀(三諾安信血糖儀)測量外周血糖濃度。單次外周血糖測量值≥14 mmol/L或者兩次測量值≥11 mmol/L被認定為造模成功[11]。對于48 h后血糖值仍正常的實驗組兔，則補加50 mg/kg 的四氧嘧啶溶液，直至血糖達到上述標準。隨后4周內每周進行血糖水平監測。4周以后兩組兔血糖水平趨于穩定。此后每隔4周行MRI檢查前測量其血糖值。

1.2 影像學檢查

1.2.1 MRI檢查方法

在造模成功后0、4、8、12、16周，對實驗兔經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液(1.3 ml/kg)進行麻醉。麻醉后將兔仰臥位足先進固定于8通道膝關節專用相控陣線圈，采用3.0 T超導MR機(Discovery MR750 Plus，GE Healthcare)對實驗兔腰椎行矢狀位FSE-T1WI、FSE-T2WI及DCE-MRI檢查。矢狀位FSE-T1WI掃描參數：TR 300 ms，TE Min Full，層厚3 mm，層間距0 mm，FOV 160 mm×160 mm，矩陣320×288。矢狀位FSE-T2WI掃描參數：TR 2500 ms，TE 120 ms，層厚3 mm，層間距0 mm，FOV 160 mm×160 mm，矩陣320×320。

DCE-MRI序列：掃描參數：采用肝臟快速容積采集(liver acquisition volume acceleration，LAVA)序列及陣列空間敏感編碼技術(array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)。首先行多反轉角LAVA序列掃描(TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，層厚3 mm，FOV 200 mm×160 mm，矩陣192×192，Chem SAT：Special，反轉角為9°及12°)，每個多反轉角序列掃描一個時相(8 s)。隨后行動態增強LAVA序列掃描(TR 3.5 ms，TE 1.0 ms，層厚3.0 mm，FOV 200 mm×160 mm，矩陣192×192，反轉角10°)，連續無間隔同層掃描420幀動態圖像，總計掃描35個時相。在基線掃描2個動態時相之后通過美國MeoRao雙筒高壓注射器經兔耳緣靜脈團注對比劑，對比劑采用歐乃影(釓雙胺，GE Healthcare，Ireland)，注射劑量為0.2 mmol/kg，流率為1.0 ml/s，隨后同樣流率注射0.9%生理鹽水5 ml沖管。

1.2.2 CT檢查方法

QCT掃描：麻醉后將兔取常規仰臥位并使下肢伸直，在腰部底下加墊固體體模(V.4.0)，利用GE Bright Speed 16排螺旋CT對腰4～7椎體進行螺旋掃描。掃描過程中需要使掃描線與椎體上下緣平行，掃描參數：管電壓120 kv，管電流250 mAs，床高179 cm，螺距0.531，SFOV=Large body，矩陣512×512，層厚5 mm，標準算法重建。

1.2.3 DCE-MRI及QCT圖像后處理及參數測定

將DCE-MRI原始數據導入Omni-Kinetics (GE Healthcare)軟件進行分析。首先對35期動態增強圖像進行3D非剛性運動校正(3D non-rigid registration)，以降低呼吸運動偽影，然后導入兩個反轉角(9°和12°) LAVA序列圖像，用于T1 mapping的計算，再將校正后的35期增強圖像導入，選擇腹主動脈內的對比劑時間濃度曲線作為腰椎的動脈輸入函數(arterial input function，AIF)，藥代動力學模型選擇擴展Tofts模型。在圖像的每一層面手動勾畫感興趣區域(region of interest，ROI)，避開椎間盤、椎基靜脈叢、骨島，采用merge功能將每個層面ROI圖像融合為三維感興趣區域(VOI)，軟件自動計算出容量轉移常數(Ktrans)、速率常數(Kep)、血管外細胞外間隙(extravascular extracellular space，EES)容積分數(Ve)(均取mean值)，重復測量三次，取各參數平均值為最終結果(圖1)。

將CT圖像上傳至Mindways Pro后處理軟件測量兔腰4～7椎骨密度值(bone mineral density，BMD)，ROI不包括骨島、椎靜脈孔、病損區域等(圖2)。

1.3 腰椎組織病理學檢查及骨小梁形態計量學

在第16周完成檢查后，所有實驗兔采取空氣栓塞法處死，取腰7椎體采用通用型組織固定液(4%多聚甲醛的緩沖溶液，pH為中性)固定，脫鈣、石蠟包埋，選取腰椎體最大橫斷面作4 μm厚薄切片，行HE染色。在光學顯微鏡(OLYMPUS BX51)高倍鏡下(×40)選取4個獨立的相同面積區域進行觀察并拍片。應用ImagePro Plus 6 (Media Cybermetic，Inc. USA)軟件對圖像進行分析，測量HE染色切片中骨小梁結構參數，包括骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁面積(Tb.Ar)(圖3)。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件，采用Pearson相關性分析第16周糖尿病組兔腰椎骨髓微血管滲透性參數與骨密度和骨小梁形態計量學參數的相關性；采用重復測量方差分析各組腰椎骨髓滲透性參數及BMD隨時間變化的趨勢，采用兩獨立樣本t檢驗比較兩組間腰椎骨髓微血管滲透性參數、骨密度、骨小梁形態計量學參數的差異，檢驗水準α=0.05，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

實驗過程中糖尿病組兔因麻醉、身體健康狀況差死亡4只，剩余10只。對照組因麻醉因素意外死亡2只，剩余8只。糖尿病組、對照組不同時間點腰椎滲透參數及BMD服從正態分布，球形檢驗結果P＞0.05，因此采用重復測量的方差分析。不同時間點滲透參數Kep、Ve在對照組差異分別具有統計學意義(P＜0.001)，而在糖尿病組差異均無統計學意義(P＞0.05)。對照組不同時間點滲透參數差異進一步兩兩比較采用LSD檢驗。對照組腰椎Kep在第4周到12周呈下降趨勢，第16周有所回升，但仍舊低于第0周水平，Ve在第4周到12周呈上升趨勢，第16周下降，但仍舊高于第0周水平(P＜0.05)。(表1；圖4～6)。不同時間點BMD在對照組及糖尿病組差異均不具有統計學意義(P＞0.05)(表1；圖7)。

表1 糖尿病組、對照組各時間點兔腰椎DCE-MRI滲透性參數和BMD值比較(±s)Tab. 1 Comparison of DCE-MRI permeability parameters and BMD values of lumbar spine between diabetic group and control group at different time points (±s)

表1 糖尿病組、對照組各時間點兔腰椎DCE-MRI滲透性參數和BMD值比較(±s)Tab. 1 Comparison of DCE-MRI permeability parameters and BMD values of lumbar spine between diabetic group and control group at different time points (±s)

注：a代表對照組內與0周比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；b代表同一點時間糖尿病組與對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)

時間點 對照組 糖尿病組 t值 P值Ktrans 0周 2.95±0.06 2.91±0.11 0.836 0.417 4周 2.95±0.06 2.76±0.45 1.203 0.267 8周 2.93±0.08 2.74±0.45 1.115 0.283 12周 2.95±0.10 2.77±0.40 1.262 0.228 16周 2.93±0.07 2.70±0.71 0.997 0.390 Kep 0周 6.71±1.26 5.42±1.94 1.573 0.138 4周 4.80±0.98a 5.66±1.82 -1.176 0.259 8周 5.16±1.29a 4.22±1.66 1.260 0.228 12周 4.25±1.03a 4.31±1.81 -0.074 0.942 16周 5.76±1.48a 5.03±2.20 0.784 0.446 Ve 0周 0.40±0.17 0.59±0.32 -1.465 0.165 4周 0.69±0.13a 0.49±0.21 2.276 0.039b 8周 0.64±0.19a 0.75±0.19 -1.097 0.291 12周 0.76±0.15a 0.72±0.25 0.394 0.700 16周 0.52±0.25 0.61±0.22 -0.767 0.456 BMD 0周 531.25±56.29 522.81±58.44 0.265 0.796 4周 525.28±63.48 514.45±54.22 0.327 0.75 8周 520.95±44.87 510.39±88.04 0.266 0.789 12周 519.53±44.97 464.63±58.73 1.909 0.083 16周 502.63±39.35 451.69±46.17 2.151 0.055

圖1 為第16周對照組增強T1WI圖及基于該圖像后處理獲得的Ktrans、Kep、Ve及Vp圖，紅色區域為手動勾畫出的腰椎ROI 圖2 QCT后處理勾畫ROI區域Fig. 1 Enhanced T1WI images of the control group and Ktrans, Kep, Ve and Vp images obtained based on the image post-processing at week 16, the red areas are the lumbar rois manually outlined. Fig. 2 ROI area delineated by QCT post-processing.

圖3 Image Pro plus軟件標記并勾畫需要測量的骨小梁輪廓 圖4～7 分別為糖尿病組、對照組腰椎Ktrans、Kep、Ve和BMD隨時間變化趨勢圖。對照組腰椎Kep呈先下降后回升趨勢，Ve呈先上升后回降趨勢 圖8，9 分別為第16周糖尿病組、對照組腰椎(HE ×40)，糖尿病組腰椎骨小梁分布稀疏，面積較小(箭；圖8)；對照組兔腰椎骨小梁數多，面積較大(箭；圖9) Fig. 3 The trabecular bone contour to be measured is marked and sketched by the Image Pro plus software. Fig. 4—7 Shows the trend of lumbar Ktrans, Kep, Ve and BMD changes over time in the diabetes group and the control group, respectively. In the control group, the Kep of lumbar spine first decreased and then increased, and the Ve first increased and then decreased. Fig. 8, 9 Shows HE staining of lumbar vertebrae in the diabetes group at week 16 and the control group (HE ×40), respectively. Lumbar vertebral trabeculae in the diabetes group are sparsely distributed with small area (arrow. Fig.8). The lumbar vertebral trabeculae of rabbits in the control group were large in number and area (arrow. Fig. 9).

第16周糖尿病組腰椎HE染色顯示骨小梁數量、面積減小(圖8，9)。糖尿病組骨小梁計數、骨小梁面積低于對照組(t=12.472；t=4.961；P＜0.001)。Pearson相關分析結果顯示Tb.N與Ktrans、Kep、Ve均無相關性(r值分別為0.135、0.093、-0.118；P＞0.05)，Tb.Ar與Ktrans、Kep、Ve均無相關性(r值分別為0.233、-0.008、-0.095；P＞0.05)。

BMD與Ktrans、Kep、Ve均無相關性(r值分別為0.497、0.513、-0.310；P＞0.05)。

3 討論

本研究首次采用DCE-MRI定量滲透性參數結合QCT的BMD評估四氧嘧啶誘導兔糖尿病骨髓微循環及骨密度的變化，研究結果顯示實驗組16周腰椎骨髓微血管DCE-MRI滲透性參數與骨面積、骨小梁數及相對骨小梁面積參數及BMD之間均無相關性，實驗組BMD值在0～16周均未出現有統計學意義的變化，而骨小梁形態計量學在16周時已出現明顯變化。

無論是T1 DM還是T2 DM，早期糖尿病骨髓微血管病變的病理生理機制尚未闡明[12-13]。糖尿病引起的骨代謝紊亂主要包括骨量減少和骨質疏松。糖尿病合并骨髓微血管病變時，將會加重骨的代謝障礙。對那些已患有原發性骨質疏松的病人，再患有糖尿病將會使骨代謝障礙的病情加重[14]。Oikawa等[13]首次顯示T1 DM大鼠的股骨、脛骨骨髓微血管病變，包括：骨髓脂肪細胞堆積以及骨量減少；微血管通透性增高、血流量減少；小動脈、毛細血管網及骨髓竇狀隙減少。Hu等[7]的研究結果顯示四氧嘧啶(ALX)誘導的兔糖尿病模型成功12周后，兔椎體骨髓微血管通透性及脂肪含量明顯增加，骨髓微血管密度減低，骨髓成骨細胞微環境破壞。目前T2 DM相關骨組織形態計量學的研究主要集中于骨代謝而非骨結構[15]，T2 DM患者的骨組織結構與健康對照組相比，具有明顯多孔的皮質和具有高骨小梁vBMD和厚度[16-17]，無骨結構性質的變化[18-20]。本實驗結果顯示實驗組16周四氧嘧啶誘導兔糖尿病腰椎骨髓微血管DCEMRI滲透性參數與骨面積、骨小梁數及相對骨小梁面積參數及BMD之間均無相關性。Rakic等[21]的研究顯示T2DM患者BMD與糖尿病病程無相關性；產生這個結果的原因，可能是因為糖尿病對骨骼系統的損害為骨強度的改變，而BMD只能反映骨強度的一個方面，BMD也許不能全面反映這種損害[22]。從本次實驗結果中筆者推測糖尿病早期骨髓微血管滲透性改變與BMD及骨小梁指標的變化不存在相關性，但是不能因此排除糖尿病病程與骨密度減低嚴重程度的相關性。確認骨髓微血管病變是糖尿病骨病的中心因素還是糖尿病骨病的誘因，對臨床預測糖尿病骨病風險及其防治具有重要參考價值，需要在微血管病發展之前就開始長期的前瞻性研究，同時進行大規模的流行病學研究，以便更好地了解骨髓微血管病與BMD改變和骨折風險之間的關系。

Ramiya等[23]研究結果顯示從成年非肥胖糖尿病小鼠的胰腺導管上皮細胞分離出細胞，并在體外培養形成了胰島樣結構移植到小鼠的腎囊或皮下組織后，可以逆轉該小鼠胰島素依賴的糖尿病。本實驗第4周到第16周骨髓Kep水平下降，Ve水平上升可能是由于胰腺的自我修復能力所致。另外，有明確證據表明高血糖與微血管疾病之間具有因果關系[24-25]以及調節血糖控制在防止微血管疾病中的重要性[26]。本次實驗過程中血糖監測結果顯示第4周以后部分糖尿病兔血糖水平呈下降趨勢，這也是實驗過程中糖尿病兔模型滲透性參數變化趨勢的原因之一。

本實驗結果顯示兔糖尿病組腰椎BMD呈下降趨勢，但在16周不同時間點的差異均不具有統計學意義，這在Register等[20]的研究結果也可得到證實。而第16周時糖尿病組與對照組腰椎骨小梁形態計量學參數的差異具有明顯統計學意義，并且BMD與骨小梁指標之間無明確的相關性。筆者推測QCT測量的腰椎BMD的變化并不能完全準確地反映組織學上骨小梁形態計量學的變化。通過微有限元分析(micro-FEA)估計的骨強度顯示，與對照組相比，2型糖尿病患者骨強度較低，與橈骨遠端皮質孔隙率增加有關[27-28]。此外，與沒有骨折的2型糖尿病患者相比，有骨折的2型糖尿病患者的骨皮質疏松和小梁異質性更明顯[29]。最近HR PQCT研究結果發現這種皮質缺損僅出現在糖尿病微血管并發癥患者身上[30]。與無骨折的2型糖尿病患者相比，有骨折的2型糖尿病患者中皮質和骨膜層的皮質空隙率更高，這表明這些皮質亞室可能對2型糖尿病引起的毒性更敏感，并可能反映微血管疾病[31]。本次實驗中，QCT測量BMD時勾畫的ROI避開了皮質區域，這可能是導致BMD下降趨勢不明顯的一個重要原因。未來的研究應更多地從評價骨脆性的結構決定因素(微觀結構、材料性質)入手來評價QCT測量糖尿病兔模型腰椎BMD的準確性及可重復性。

本研究存在一些不足。首先，本次實驗對象是動物模型，研究時長僅為16周，與臨床糖尿病患者慢性代謝性疾病自然病程存在差異，本次實驗結果只能說明糖尿病早期骨髓微血管滲透性改變與BMD的變化不存在相關性，而二者之間的完整時序變化規律仍有待進一步研究；其次，本實驗所有兔腰椎QCT檢查實驗周期內多次進行DCE-MRI檢查，未能評價靜脈注射釓劑對腰椎QCT測量結果的影響；最后，本實驗未能在實驗全程對骨小梁標本結果進行連續多期觀察，在后續開展的研究中有待進一步完善。

綜上所述，四氧嘧啶兔糖尿病早期腰椎骨髓微血管滲透性參數變化與骨密度和骨小梁形態計量學參數無相關性，QCT測量的骨髓BMD變化晚于骨小梁形態計量學的變化。

利益沖突：無。