豬細(xì)小病毒生物學(xué)研究進(jìn)展

陳玉梅，馬麗萍，周景明

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)屬細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、原細(xì)小病毒屬(Protoparvovirus)中的有蹄類原細(xì)小病毒1(Ungulateparvovirus1，UPV1)[1]。PPV最早于20世紀(jì)60年代末被確認(rèn)為細(xì)小病毒科成員，是SMEDI綜合征(Stillbirths,mummification,embryonic death and infertility，SMEDI)即豬死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕的病原體[2]，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。一直以來，人們認(rèn)為PPV的遺傳變異性很低，通過接種疫苗可以很好地控制該病毒的傳播。然而，隨著不能被經(jīng)典PPV疫苗的抗血清有效中和的強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，人們逐漸意識到該病毒的多樣性比先前預(yù)期的要大得多。因此，追蹤PPV研究的最新成果，全面更新對PPV生物學(xué)的理解，對于制定PPV的有效防控策略具有重要意義。

1 PPV的分子生物學(xué)特性

PPV是一種小的、無包膜的單鏈DNA病毒，基因組長4～6.3 kb[3]。病毒的2個(gè)末端序列形成大約120～200個(gè)堿基的復(fù)雜回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)(呈類似的“Y”或“T”形)[4]。PPV的緊湊型基因組只包含2個(gè)啟動子，共編碼7種蛋白質(zhì)，并利用選擇性剪接技術(shù)來擴(kuò)展基因組的編碼能力。2種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2是從p4啟動子轉(zhuǎn)錄而來，這些蛋白質(zhì)對病毒復(fù)制特別是DNA復(fù)制很重要[4]；另外，還可能含有1種假定的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3。PPV的2種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)從p40啟動子轉(zhuǎn)錄。二者是從一組嵌套的編碼序列中翻譯出來的，它們的氨基末端不同，較小的VP2是從與較大的VP1相同的RNA模板中剪接產(chǎn)生的。VP1有729個(gè)氨基酸殘基，其中氨基末端前120個(gè)氨基酸是VP1特有的(VP1 unique region，VP1u)。而PPV的第3種結(jié)構(gòu)蛋白VP3是VP2的翻譯后修飾產(chǎn)物。此外，晚期非結(jié)構(gòu)蛋白(SAT)是由與VP2相同的mRNA啟動VP2起始密碼子下游的7個(gè)核苷酸表達(dá)而來的。PPV的外殼是由60個(gè)VP1或VP2結(jié)構(gòu)蛋白分子組成的球形結(jié)構(gòu)，呈二十面體對稱排列。每個(gè)衣殼亞單位由8條反平行β鏈及1個(gè)α螺旋和4個(gè)環(huán)組成(圖1)[4-5]。VP1蛋白大約占病毒粒子的10%，主要在病毒復(fù)制和感染細(xì)胞時(shí)發(fā)揮作用，VP2蛋白是PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒粒子的60%以上，也是病毒的主要免疫原性蛋白。VP1、VP2基因?qū)τ赑PV的系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要[6]。

圖1 PPV VP2蛋白3D模型(A)及病毒衣殼結(jié)構(gòu)(B)Fig.1 3D model of PPV VP2 with the cartoon technique(A) and the structure of PPV capsids(B)

2 PPV發(fā)病機(jī)制

PPV毒株毒力是由其可能引起的繁殖失敗的嚴(yán)重程度來定義的[7]。大多數(shù)情況下，未懷孕成年豬或仔豬單純感染PPV不會出現(xiàn)臨床癥狀，而胎兒感染的結(jié)果隨母豬妊娠的進(jìn)展而變化，流行病學(xué)研究表明，母豬妊娠前半期PPV感染可導(dǎo)致生殖衰竭，PPV經(jīng)口服途徑初次感染母豬后23～32 d穿過胎盤，經(jīng)肌肉注射途徑感染時(shí)間稍短，約15 d[8]。研究發(fā)現(xiàn)，僅在胎兒產(chǎn)生抗體前發(fā)生的感染才會導(dǎo)致死亡和木乃伊化，妊娠70 d后，胎兒產(chǎn)生抗體反應(yīng)，通常在這一時(shí)期以后的感染胎兒可以存活(圖2)[2]。除感染時(shí)間外，病毒的遺傳組成對胎兒感染的結(jié)果有決定性影響，低致病性毒株和疫苗株(如NADL-2和MSV)不能像高致病性毒株(如Kresse毒株和27A毒株)一樣有效地穿過胎盤屏障[7]，因此，不易檢測到它們對妊娠的影響。然而，直接向羊水中注射NADL-2毒株可導(dǎo)致胎兒死亡[9]。而關(guān)于PPV如何通過胎盤屏障誘導(dǎo)生殖失敗還不清楚，沒有證據(jù)表明PPV可在子宮上皮中復(fù)制，因此，通過屏障復(fù)制理論不成立[7]。單核細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞可吞噬NADL-2，據(jù)此有研究者猜測PPV可通過母體巨噬細(xì)胞侵入胎兒[10]。事實(shí)上，目前并沒有任何直接證據(jù)表明巨噬細(xì)胞可以將PPV從母親直接傳遞到胎兒。

用不同毒株P(guān)PV感染妊娠母豬的試驗(yàn)表明，NADL-8毒株要達(dá)到可經(jīng)胎盤妊娠感染所需的毒量是NADL-2毒株的10 000倍以上[11]。而PPV不同毒株感染的胚胎中病毒DNA的組織分布和數(shù)量存在顯著差異，在肝臟中通過原位雜交試驗(yàn)檢測到Kresse毒株和NADL-8毒株，而在大腦和脾臟僅檢測到Kresse毒株[12]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，PPV 27a分離株在包括結(jié)腸、十二指腸、空腸、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺、性腺等10個(gè)不同胎兒器官中的病毒滴度在1011～1015拷貝/106個(gè)細(xì)胞，而毒性較小的PPV-143a毒株和疫苗株(NADL-2毒株和MSV毒株)主要在腎臟中檢出，且病毒滴度較低(<103拷貝/106個(gè)細(xì)胞)[9]。相關(guān)研究結(jié)果表明，PPV毒株的組織特異性及其在胚胎中感染起始能力的差異可能在胎兒感染及致病性方面發(fā)揮重要作用[9-12]。

圖2 PPV感染和免疫應(yīng)答的主要時(shí)間點(diǎn)Fig.2 Major time points of PPV infection and immune response

3 PPV與細(xì)胞的相互作用

在乳豬和老年豬體內(nèi)靶細(xì)胞中檢測PPV比較困難。研究顯示，PPV可以在活化的淋巴細(xì)胞中復(fù)制，但不能在血液單核細(xì)胞中復(fù)制，而在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力還存在爭議[2]。PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PPV可在心臟、肺臟、腎臟、脾臟、子宮內(nèi)膜和小腸的細(xì)胞中繁殖，然而，PCR檢測卻不能區(qū)分是器官自身細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒還是通過血液循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)牟《綶9,13]。PPV進(jìn)入細(xì)胞的第一步是病毒離子與細(xì)胞表面糖蛋白的末端唾液酸位點(diǎn)結(jié)合，胞吞作用抑制劑阻斷試驗(yàn)結(jié)果表明，除了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和大胞飲作用外，還有第3種未知的進(jìn)入機(jī)制可能參與PPV入胞，而小窩蛋白(Caveolae)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑不起任何作用，單個(gè)PPV顆粒傾向于通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)，而PPV聚集物傾向于大胞飲作用[14]。核內(nèi)體易位到晚期核內(nèi)體或溶酶體以及感染后2～10 h的酸化作用對PPV的有效感染至關(guān)重要[14]。研究表明，泛素化以及細(xì)胞質(zhì)中蛋白酶體的相互作用是PPV有效感染必不可少的步驟，病毒顆粒向細(xì)胞核運(yùn)動時(shí)涉及微管和肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)。微管在感染前8～10 h至關(guān)重要，這表明微管在PPV向核周區(qū)的內(nèi)質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用。在感染后期(12～16 h)肌動蛋白活性對增殖性感染是必需的，它可能對傳入病毒的轉(zhuǎn)運(yùn)以及對新合成蛋白質(zhì)的核轉(zhuǎn)運(yùn)都是必需的[14]。

核定位序列(Nuclear localization signals,NLS)對蛋白質(zhì)能被順利轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核至關(guān)重要。腺相關(guān)病毒的衣殼蛋白具有4個(gè)潛在的NLS，分別為以下4個(gè)基本區(qū)域(Basic region,BR)：BR1、BR2、BR3和BR4。類似于小鼠微小病毒(Minute virus of mice，MVM)，PPV的VP1u含有5個(gè)潛在的NLS，即BR1 (3PPAKRAR9)、BR2 (86RAKR89)、BR3 (110RRSPRK115)、BR4 (124KR125)和BR5 (133KKKAK137)[15]。其中BR1是1個(gè)經(jīng)典的含有7個(gè)氨基酸的NLS，而BR4和BR5是典型的二元核定位信號(Bipartite NLSs,B-NLSs)，這2種NLSs都是病毒復(fù)制的必要條件[16]，它們的突變不影響病毒的裝配，但可影響病毒增殖，表明它們在感染早期負(fù)責(zé)病毒的核轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，在PPV衣殼中還可能存在3個(gè)非線性核定位基序(Nuclear localization motif,NLM)，包裝好的PPV衣殼表面的外部區(qū)域(包含R374、R393和R565)、PPV VP2三聚體內(nèi)部區(qū)域的中心區(qū)域(包含K475、R477)及病毒衣殼內(nèi)表面的內(nèi)部區(qū)域(包含K272、K275、K487、R533、K535、R576)[15-16]。在所有原細(xì)小病毒中，VP1 NLS和VP2 NLM在病毒裝配過程中被內(nèi)化到細(xì)胞核中，且不可接近轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究證明，MVM是主動從核中運(yùn)輸出來的[17]。據(jù)推測在原細(xì)小病毒粒子上，NLM或NLS的存在會干擾這種傳輸。然而，對PPV而言，目前并沒有任何證據(jù)表明組裝好的PPV病毒離子可以向細(xì)胞膜的任何囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。

目前，已知的大多數(shù)影響PPV生物學(xué)特性的突變都是在衣殼蛋白上發(fā)現(xiàn)的，唯一例外的是NADL-2毒株NS1蛋白的I481L突變，該突變位點(diǎn)與VP2的N348H突變一起作用有助于NADL-2毒株在犬細(xì)胞系A(chǔ)72中產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)并以高滴度復(fù)制。NADL-2毒株和Kresse毒株的基因組在右端尾部發(fā)夾結(jié)構(gòu)附近有13個(gè)核苷酸(Nucleotides,nt)和127 nt的重復(fù)序列。這2種病毒的結(jié)構(gòu)蛋白之間只有6個(gè)氨基酸差異，其中5個(gè)氨基酸差異(I215T、D378G、H383Q、S436P和R565K)也存在于其他毒力毒株中。定位于衣殼表面的3個(gè)氨基酸差異(D378G、H383Q和S436P)使NADL-2毒株不能在原代牛睪丸細(xì)胞(TV)中復(fù)制，并將滴度和細(xì)胞病變效應(yīng)降低到與豬源細(xì)胞系(PT和PFT)中Kresse毒株相當(dāng)?shù)乃絒18]，后來發(fā)現(xiàn)，S436P在體外不參與組織向性[3]。由于在毒力毒株(27a毒株)和無毒力毒株(143a毒株)的436位氨基酸均為蘇氨酸(Thr)，進(jìn)一步從側(cè)面證實(shí)VP2的D378G和H383Q的氨基酸突變可能改變PPV的致病性[7]。

PPV感染后3 h可促進(jìn)PK-15細(xì)胞中p53的積累，p53通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑激活Caspase-9和Caspase-3，從而使線粒體釋放細(xì)胞色素C[19]。在PPV YL株感染60 h后的豬睪丸細(xì)胞(ST)和PK-15細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的比例可達(dá)50%，而在PPV Kresse毒株感染的PT細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的數(shù)量仍低于14%[2,20]。Kresse毒株感染期間PT細(xì)胞死亡的主要形式包括感染核腫脹、早期細(xì)胞膜衰竭(如碘化丙啶攝取)、乳酸脫氫酶快速釋放和病毒DNA自由釋放，這些形式最終均指向壞死[20]。即使PPV衣殼的微小突變也能改變其與宿主間的相互作用，并改變病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)[2,21]。PPV感染所引發(fā)的病變效應(yīng)在很大程度上取決于毒株類型和細(xì)胞類型。然而，細(xì)胞早期解體加速了PPV的體外釋放和擴(kuò)散，這些過程對體內(nèi)病毒的生命周期有非常顯著的影響。在PPV中已經(jīng)進(jìn)化出一種可以促進(jìn)細(xì)胞快速溶解和病毒釋放的小的選擇性翻譯蛋白(Small alternatively translated protein,SATp)，該蛋白與VP2共用1套mRNA，其起始密碼子是VP2起始密碼子下游的7個(gè)核苷酸。SATp是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留的短膜蛋白(68AA)，包含1個(gè)跨膜螺旋，可加速細(xì)胞死亡和病毒傳播[2]。無論是否存在SATp，在受感染的PT細(xì)胞中，PPV感染都會誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)。在感染后12～14 h，它還導(dǎo)致抗凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)可逆地激活。在感染后期，SATp的存在通過使ER應(yīng)激不可逆加速細(xì)胞凋亡。

4 PPV的遺傳變異與進(jìn)化

一直以來，研究者認(rèn)為PPV的基因組比其他細(xì)小病毒更保守[5]。然而，最近研究者發(fā)現(xiàn),PPV的基因組并不是原以為的那么保守，通過系統(tǒng)研究野外分離株中VP蛋白的遺傳多樣性，PPV至少分為7個(gè)簇(Cluster)，其中C和D簇中歐洲毒株占優(yōu)勢，而F簇中中國毒株占優(yōu)勢，未觀察到野豬分離株的分簇與地理分布的相似關(guān)系[4]。在同一地區(qū)，從野豬種群中檢測到的PPV較家豬群中的PPV多樣性更豐富。相關(guān)研究表明，傳統(tǒng)的PPV疫苗株的抗血清不能有效中和D簇中一些新的強(qiáng)毒株[22]。據(jù)推測，這些突變體可能是逃避疫苗接種所帶來的免疫壓力而產(chǎn)生的。然而，根據(jù)現(xiàn)有的序列分析發(fā)現(xiàn)，在組織培養(yǎng)或接種牛群中存在抗體時(shí)，觀察到的PPV遺傳多樣性降低，而在疫苗株衣殼上發(fā)現(xiàn)的一些突變位點(diǎn)(NADL-2毒株 I320S、H383Q及Str.Challenge毒株S45T、P436S)也沒有出現(xiàn)在新的PPV突變體上[23]。因此，可以認(rèn)為疫苗接種失敗和未接種動物(如野豬)種群對新出現(xiàn)的表型產(chǎn)生的影響可能比接種種群更重要。

PPV分離株的系統(tǒng)發(fā)育與毒力之間沒有顯著的相關(guān)性。病毒毒力強(qiáng)弱可能直接或間接影響如組織特異性和長期/高滴度脫落等生物學(xué)特征，這也決定了PPV毒株在高度可變的田間條件下的適宜性。對田間毒株的NS和VP基因突變模式的研究表明，這2個(gè)編碼區(qū)的進(jìn)化有明顯差異，VP基因的突變率是其中1個(gè)NS基因(10-5)的30～50倍(約3～5×10-4突變/核苷酸·年)[2]。這與在NS區(qū)域發(fā)現(xiàn)的非同義和同義取代率之間的負(fù)差異一起表明，允許NS蛋白質(zhì)維持功能的核苷酸變化數(shù)量是有限的，同時(shí)純化選擇(Purifying selection)即負(fù)選擇(Negative selection)決定了該區(qū)域的進(jìn)化。相反，早期的研究表明，VP1/VP2基因是在近中性模式(漂移)下進(jìn)化的[2]，但在決定細(xì)胞相互作用和免疫原性的衣殼外環(huán)上的幾個(gè)位置被正選擇(Positive selection)[24]。此外，大多數(shù)突變發(fā)生在表面環(huán)，其中215、228、383、414、419、436位氨基酸似乎是衣殼中的主要可變位點(diǎn)[2,24]。普遍認(rèn)為，小DNA病毒中CpG缺失的主要原因是來自復(fù)制優(yōu)勢和/或免疫逃逸的自然選擇。PPV基因組是CpG缺失的，CpG位點(diǎn)比PPV基因組中的GC或C和G位點(diǎn)更容易發(fā)生突變。因此，突變壓力而不是選擇力，是導(dǎo)致PPV基因組中CpG表達(dá)不足的原因[2]。

5 PPV的檢測與預(yù)防

PPV常用的檢測方法有分子生物學(xué)檢測方法、血清學(xué)檢測方法等，其中分子生物學(xué)檢測方法主要包括常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[25]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、聚合酶重組酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)[26]以及基因芯片檢測技術(shù)等[2]。由于PPV能凝集雞、豚鼠、小鼠、人、猴、鼠和貓的紅細(xì)胞，因此，血凝(Hemagglutination assays，HA)和血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition assays，HI)仍然是一種有效的PPV血清學(xué)檢測方法，在研究和實(shí)踐中廣泛使用。而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是最常用的檢測PPV特異性抗體的方法；血清學(xué)方法還包括病毒中和試驗(yàn)、改良的直接補(bǔ)體結(jié)合(Modified direct complement-fixation，MCDF)試驗(yàn)等。另外，還有基于NS1蛋白的區(qū)分感染動物和接種動物的重組DIVA(Differentiating infected from vaccinated animals)試驗(yàn)等[2]。一旦感染PPV則很難清除，所以控制PPV流行的主要措施是接種疫苗。目前，使用較廣泛的疫苗是PPV滅活苗和弱毒苗，另外PPV病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的研究也很多，PPV疫苗的應(yīng)用在很大程度上控制了PPV的流行和傳播[27]。但由于PPV新的強(qiáng)毒株的出現(xiàn)及經(jīng)典疫苗防治失敗的案例的出現(xiàn)對PPV疫苗提出來新的挑戰(zhàn)。

6 小結(jié)

隨著生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，PPV的分子生物學(xué)相關(guān)研究已取得了很大進(jìn)展，在PPV的檢測與預(yù)防方面也取得了進(jìn)展，PPV疫苗的使用在很大程度上控制了PPV的流行和傳播。但是，依然會有因免疫失敗引發(fā)的PPV疫情報(bào)道。一直以來，人們認(rèn)為該病毒的遺傳變異性很低，然而，隨后的研究揭示了該病毒的多樣性比先前預(yù)期的要大得多，PPV的核苷酸替換率大約為每年每個(gè)位點(diǎn)對NS1基因進(jìn)行10-5次替換，每年每個(gè)位點(diǎn)對VP1和VP2基因進(jìn)行10-4次替換，這些比率與RNA病毒中的核苷酸替代率相似[2,3,28]。因此，隨著時(shí)間的推移，常有新的PPV毒株出現(xiàn)，對養(yǎng)豬業(yè)造成潛在的威脅。在過去的幾年里，也有許多新的PPV毒株被報(bào)道，但是關(guān)于這些病毒在發(fā)生和流行的信息及其更深入的研究卻很缺乏。適時(shí)追蹤PPV研究前沿，密切監(jiān)測新毒株的出現(xiàn)，并對這些新毒株與經(jīng)典流行毒株的致病性等特征進(jìn)行深入研究，對于新型廣譜疫苗的研制及有效防控PPV新毒株的流行具有重要意義。