發酵果汁膠原蛋白飲料的研制及其活性研究*

王少群，邱丹騰，林春通，張紅，劉樹滔

（1.廈門信道生物技術有限公司，福建 廈門 361026；2.福州大學生物工程研究所，福建 福州 350108）

膠原蛋白的基本結構單元是原膠原，由具有3條左手螺旋α肽鏈相互纏繞形成的右手螺旋結構的一類蛋白質[1]。因其含量豐富，來源廣泛，水解產物具有多種生物活性功能，廣泛應用于食品、化妝品、生物醫療等各個領域。

膠原蛋白飲料是通過添加膠原蛋白源（如膠原蛋白、膠原蛋白肽），并對其它各個組分調配形成的一種功能性飲料。對它的研究很多，主要為保健膠原蛋白飲料，如生姜-膠原蛋白[2]、木瓜-膠原蛋白[3]、枸杞子-膠原蛋白[4]、大棗-膠原蛋白[5]等，但多以配方優化為主，鮮有健康功能性研究。通過對京東（https://www.jd.com/）和淘寶（https://www.taobao.com/）的調查，發現膠原蛋白飲料多為果味飲料，產品風味欠佳，功能效果有限。

發酵果汁是由乳酸菌/酵母菌等益生菌對果汁的發酵而形成的營養食品，風味獨特，且具有新的營養和保健功能[6]。國內外對發酵果汁飲料的研究很多，主要分為：⑴各種果蔬為主的發酵果汁飲料[7-9]；⑵不同菌種形成的單菌種發酵果汁或多菌種混合發酵果汁飲料[10,11]；⑶搭配藥食同源食材的發酵果汁飲料[12,13]；⑷少數搭配動物源食材（如：膠原蛋白）的發酵果汁飲料[14]。然而，通過發酵果汁與膠原蛋白的組合以改善產品風味，提升功能效果的研究較少。

為了使膠原蛋白飲料更容易為市場所接受，本文以膠原蛋白肽為原料，添加發酵果汁和其它輔料，研制口味良好、功能多樣的發酵果汁膠原蛋白飲料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

海嬌-膠原蛋白肽凍干粉：購自上海利統生化制品有限公司；保和堂-膠原蛋白果汁飲料：上海葡萄王企業有限公司；天然派-膠原蛋白果汁飲品：深圳市天然派生物科技有限公司；依蓮-膠原蛋白液態飲品：上海中邦斯瑞生物藥業技術有限公司；益盛漢參-膠原蛋白肽果汁飲品：時代生物科技（深圳）有限公司；Lumi-膠原蛋白液態飲品：大江生醫股份有限公司；日本芳珂-膠原蛋白果汁飲料：日本FANCL株式會社。

表1 發酵果汁膠原蛋白飲料配方表 單位：g

發酵紅棗濃縮汁、發酵復合莓汁、發酵木瓜汁、發酵蘋果汁、發酵檸檬汁、藍莓濃縮汁、發酵西柚汁、發酵蘋果濃縮果汁等：購自福建綠泉食品有限公司。

阿斯巴甜、檸檬酸、蘋果酸、果膠、黃原膠等食品添加劑：購自廈門榮新盛食品有限公司；T-AOC試劑盒、總蛋白定量測試盒（雙縮脲法）：南京建成生物工程有限公司；其余藥品均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

U-1900型紫外-可見分光光度計、CF15RX型高速離心機：日本日立公司；

恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 飲料配方

詳細配方見表1。

1.4 方法

1.4.1 飲料的口味確定

1.4.1.1 感官評價方法及標準

評價項目及評價標準見表2，等級劃分標準見表3，評價流程如下：

對發酵果汁飲料作隨機編號→準備干燥、潔凈的杯子對應發酵果汁飲料編號→組織10個人感官評價小組，品嘗發酵果汁飲料并作評價。

1.4.1.2 不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價

選擇6款市面上典型的膠原蛋白飲料作感官評價，分別為：

⑴ 保和堂-膠原蛋白果汁飲料；⑵ 天然派-膠原蛋白果汁飲品；⑶ 依蓮-膠原蛋白液態飲品；⑷ 益盛漢參-膠原蛋白肽果汁飲品；⑸ Lumi-膠原蛋白液態飲品；⑹ 日本芳珂-膠原蛋白果汁飲料。

1.4.1.3 不同口味發酵果汁的感官評價

選擇5種不同風味的發酵果汁，包括：

表2 感官評價評分標準

表3 感官評價等級劃分標準

⑴ 發酵紅棗濃縮汁；⑵ 發酵復合莓汁；⑶ 發酵木瓜汁；⑷ 發酵蘋果汁；⑸ 發酵檸檬汁。

分別稀釋5倍后，做感官評價。

1.4.1.4 不同口味發酵果汁膠原蛋白飲料的感官評價

按照1.3飲料配方分別調配成發酵果汁膠原蛋白飲料，并做感官評價。

1.4.2 飲料的制備

按照常規的果汁飲料工藝流程制備發酵果汁膠原蛋白飲料。

1.4.3 飲料的產品質量分析

由福建省產品質量檢驗研究院進行產品質量分析，檢測項目包括：可溶性固形物（20 ℃ 折光計法）；總酸（以檸檬酸計）；菌落總數；大腸桿菌；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；霉菌；酵母菌。

1.4.4 飲料的抗氧化能力測試

1.4.4.1 鹽酸羥胺法

采用黃嘌呤氧化酶（羥胺法）測定樣品對·O2-的清除能力，步驟按照論文[15]所述的SOD酶活測定方法。

式中，A2—空白組吸光值；A1—樣品組吸光值。

1.4.4.2 鐵離子還原法

抗氧化物質能使反應體系的Fe3+還原成Fe2+，可與菲啉類物質形成穩固的有色絡合物，可根據比色法測定。步驟參照總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒。

1.4.4.3 DPPH自由基清除法采用DPPH法測定樣品對DPPH·的清除能力[16]。

式中，A2—空白組吸光值；A1—樣品組吸光值。

1.4.5 飲料的體外消化率測試

根據蛋白質/多肽都具有雙縮脲反應，本文以雙縮脲法測定樣品的膠原蛋白肽含量，以反應飲料在體內被胃/腸道消化利用的程度。

模擬胃液/腸液配方——參照美國藥典[18]。

模擬胃液：NaCl 2.0 g，胃蛋白酶3.2 g，HCl 7.0 mL，用ddH2O定容至1000 mL。

模擬腸液：

A液：KH2PO4 6.8 g，ddH2O 500 mL，用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH值至6.8；

B液：胰蛋白酶10 g，加入適量ddH2O使溶解；

A、B液邊攪拌邊混勻，用ddH2O定容至1000 mL。

樣品制備：取樣品（60 mg/mL，50 mL）加入500 mL模擬胃液/腸液，37 ℃水浴，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h取出2 mL×3組作為待測溶液。

步驟：參照總蛋白定量測試盒（雙縮脲法），蛋白質含量用C表示。

式中，C0—未消化時的蛋白質濃度；C1—不同消化時間的蛋白質濃度。

1.4.6 飲料的抗疲勞能力測試

⑴ 負重游泳實驗[19]：

對小鼠（約28 g）進行樣品灌胃，0.5 h后，4個水桶分別放入6只尾部負荷5%體質量鉛皮的小鼠，使其于水溫為28 ℃、直徑為35 cm、高32 cm的水桶中游泳。小鼠沉入水中連續3次，每次如果超過10 s無法重新浮出水面稱為力竭。游泳開始至力竭的時間，為負重游泳時間。

⑵ 文獻表明[20]，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）對機體具有抗疲勞能力，故作為陽性對照。

⑶ 給藥量：對照組灌胃生理鹽水0.24 mL，SOD組灌胃SOD（400 U/mL）0.24 mL，木瓜飲料組和復合莓飲料組灌胃每只0.24 mL，見表4。

式中，T0—空白組的負重游泳時間；T1—不同樣品組的負重游泳時間。

1.5 數據處理

采用origin 9.0、excel 2013軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 飲料的口味確定

2.1.1 不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價

圖1 不同品牌膠原蛋白飲料感官評價結果

感官評定總分中（圖1），保和堂和芳珂屬于B級，依蓮、益盛漢參、Lumi屬于C級，天然派屬于D級，沒有一個品牌達到A級；口感+氣味中，保和堂、益盛漢參屬于C級，天然派、依蓮屬于D級，芳珂屬于B級，沒有一個品牌達到A級。所以，不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價皆未能達到最佳等級。

2.1.2 不同口味發酵果汁的感官評價

為研制較佳口味膠原蛋白飲料，需要尋找較佳口味的發酵果汁作基礎。

圖2 不同口味發酵果汁感官評價結果

感官評定總分中（圖2），發酵紅棗濃縮汁、發酵蘋果汁、發酵檸檬汁屬于C級，發酵復合莓汁、發酵木瓜汁都屬于B級；口感+氣味中，發酵紅棗濃縮汁、發酵木瓜汁屬于B級，發酵復合莓汁屬于A級，發酵蘋果汁、發酵檸檬汁都屬于C級。在感官評價總分/口感氣味中，不同口味的發酵果汁的評分等級主要分布為B、C級水平，但還未達到最佳A級，而發酵蘋果汁的評分最差。

綜上，選擇發酵紅棗濃縮汁、發酵復合莓汁、發酵木瓜汁、發酵檸檬汁為發酵果汁膠原蛋白飲料的后續實驗的果汁基礎。

2.1.3 不同口味發酵果汁膠原蛋白飲料的感官評價

按照1.3飲料配方調配成發酵果汁膠原蛋白飲料，以膠原蛋白液、芳珂膠原蛋白飲料做對比，通過感官評價選擇最受歡迎的2種果汁飲料。

圖3 不同口味發酵果汁膠原蛋白飲料感官評價結果

由圖3可得，隨著膠原蛋白含量的增加，膠原蛋白飲料的感官評價分數呈降低的趨勢。這是因為加入越多的膠原蛋白肽，果汁的香味越難以掩蓋魚皮膠原蛋白特有的腥臭味，進而影響飲料的風味；從感官評價總分/口感氣味分數看，發酵木瓜型和發酵復合莓型2種口味的飲料略受歡迎，即便與芳珂膠原蛋白飲料對比，亦相差不大。

因此，選擇發酵木瓜和發酵復合莓膠原蛋白果汁飲料作后續配方優化。

2.2 飲料的制備

為達到最佳的口感、色澤以及滿足人體每日對膠原蛋白的需求，經糖酸比（酸∶檸檬酸+蘋果酸）、膠原蛋白肽含量優化，飲料配方最終確定如表5。

2種飲料的最佳配方為：

⑴ 發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料根據表1調配，且糖酸比38∶1（糖∶檸檬酸∶蘋果酸=25∶0.35∶0.3=90∶1.26∶1.08），膠原蛋白肽含量6%；

⑵ 發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料根據表1調配，糖酸比18∶1（糖∶檸檬酸∶蘋果酸=25∶0.8∶0.6=90∶2.88∶2.16），膠原蛋白肽含量6%。

表5 發酵果汁膠原蛋白飲料配方表 單位：g

2.3 飲料的產品質量分析

發酵木瓜/復合莓果汁膠原蛋白飲料的pH值分別為4.32和4.14，均小于4.5，屬于酸性飲料。經巴氏滅菌法（90 ℃，15 min）滅菌后的產品質量分析如表6。參照食品安全國家標準GB4789.2-2016，檢驗結果顯示各項指標均為合格。

表6 發酵果汁膠原蛋白飲料的產品質量分析

2.4 飲料的抗氧化能力

圖4 發酵果汁膠原蛋白飲料的抗氧化能力

通過3種方法檢測發酵果汁膠原蛋白飲料的抗氧化能力，一定程度的表明其生物活性，結果如圖4所示。

由圖4可得：

⑴ 2種發酵果汁膠原蛋白飲料和膠原蛋白肽都具有一定程度的抗氧化能力。

⑵ 三種樣品的抗氧化能力（用K表示）順序：K發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞K發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞K膠原蛋白肽。

⑶ 膠原蛋白肽的基礎上，添加發酵木瓜/復合莓果汁，有助于抗氧化能力的增加。

2.5 飲料的體外消化率

生物蛋白質屬于大分子物質，在進入人體胃/腸道內，一般被降解消化成小分子物質，才易被吸收，且分子越小，越容易被吸收。所以，通過檢測發酵果汁膠原蛋白飲料的體外消化率，一定程度反應飲料在胃/腸道內的吸收情況。體外消化率如圖5所示。

圖5 發酵果汁膠原蛋白飲料的體外消化率

發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料、發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料、膠原蛋白肽、BSA在模擬胃/腸液體系中的消化結果，有著大致相同的結論。

⑴ 隨著消化時間延長，胃/腸道體系對樣品的體外消化率總體上呈現上升趨勢，即蛋白質/多肽被降解成更小分子。

⑵ 在胃/腸液體系，發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料和發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料的消化率（用D表示）比膠原蛋白肽的消化率稍高，即D發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料≈D發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料≥D膠原蛋白肽，表明發酵木瓜/復合莓果汁的添加，有助于膠原蛋白肽的降解消化，更加有利于人體吸收。

⑶ 各樣品在腸液中的消化率比在胃液中的消化率顯著較高，說明樣品的消化吸收可能主要發生在腸道環境。

2.6 飲料的抗疲勞能力

圖6 發酵果汁膠原蛋白飲料的抗疲勞能力

灌胃SOD、發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料、發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料的小鼠抗疲勞能力都有顯著提高（p＜0.05），抗疲勞能力排序為：F發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞FSOD＞F發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞50%。

3 結論

⑴ 以發酵木瓜/復合莓口味作為飲料的果汁基礎口感最好，其中：最適糖酸比分別為38∶1和18∶1；膠原蛋白肽含量皆為6%。

⑵ 飲料的抗氧化實驗：2種果汁飲料皆具有抗氧化活性，其順序為：K發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞K發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞K膠原蛋白肽，說明在膠原蛋白肽的基礎上，添加發酵木瓜/復合莓果汁有助于抗氧化能力的增加。

⑶ 飲料的體外消化率實驗：飲料的體外消化率D發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料≈D發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料≥D膠原蛋白肽，表明發酵木瓜/復合莓果汁的添加，有助于膠原蛋白肽的降解消化，更加有利于人體吸收。

⑷ 飲料的抗疲勞實驗：灌胃2種飲料皆能顯著提高小鼠的抗疲勞能力（p＜0.05），抗疲勞能力排序為：F發酵復合莓果汁膠原蛋白飲料＞F發酵木瓜果汁膠原蛋白飲料＞50%。

所以，在體外消化率相當的基礎上，小鼠的抗疲勞能力與飲料的抗氧化能力呈正相關。

綜上，本文研制的發酵果汁膠原蛋白飲料具有口感好、生物活性功能多樣的特點，可望為市場所接受。