普通小麥 TaZIP29-7B 基因的克隆及表達研究

張嘉程，高 翔，，董 劍，，楊明明,，李曉燕,，趙萬春,

(1.西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100; 2.陜西省小麥工程技術研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

小麥作為人類主要糧食作物之一，其種植環境也受到巨大挑戰，例如高溫、干旱、凍害、鹽脅迫及重金屬污染等。金屬離子在植物的生長發育過程中起到極其重要的作用，但如果吸收過量會導致體內蛋白結構發生不可逆的改變，從而影響植物的正常生長發育。

鋅和鐵是生物體所必需的微量元素，在植物的生長發育過程中有著重要作用[1]。鋅不僅參與機體的各種代謝，在生物膜穩定和基因表達調控等生理機能中也擔負著重要角色[2]，它還是生物體內多種酶和蛋白質的結構輔助因子。適量增加植物體內的鋅可提高作物產量，而鋅的缺乏或過量都會導致葉綠素、脂質、蛋白、質膜的氧化破壞，例如過量的鋅會破壞小麥體內活性氧清除系統造成MDA 積累，細胞膜透性變大，致使細胞內酶及代謝作用區域受到破壞[3]。鐵在細胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應過程中發揮重要作用，是重要的電子傳遞體[4]。因此，鐵在原核和真核生物的新陳代謝過程中有著無法替換的作用。但是細胞內過高的 Fe3+/Fe2+氧化還原勢會導致超氧化合物的產生，對細胞造成傷害[5]。因此，保證植物體內的各種金屬離子的平衡對植物的正常生長是非常必要的，這一過程要依靠多種轉運體的共同參與，包括鋅、鐵轉運體蛋白家族(Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)、自然抗性相關巨噬蛋白家族(The natural resistance associated macrophage protein，NRAMP)、陽離子擴散輔助蛋白家族(Cation diffusion facilitator proteins，CDF)、植物重金屬 ATP 酶家族 P1B-ATPase(Heavy metal ATPa-ses，HMA)、黃色條紋蛋白家族(yellow stripe-like，YSL)和三磷酸結合盒轉運蛋白(ATP-binding cass-ette transporter),這些運輸蛋白對于植物鋅鐵吸收、體內分配以及維持細胞內鋅鐵離子的平衡具有重要作用[6-7]。

目前在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、玉米(Zeamays)等少數植物中對ZIP的研究比較多。ZIP基因家族的功能分析表明，該基因家族在從胞外向胞內轉運并在胞內進行鋅運輸過程中起重要作用[1]。酵母功能互補試驗顯示ZIP家族基因能夠轉運包括Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+在內的多種金屬離子[8]。AtIRT3能互補鋅、鐵轉運雙突變體，過表達AtIRT3會使鋅在地上部、鐵在地下部積累[9]。在研究水稻ZIP家族基因時研究人員發現，OsIRT1過表達可使地上部、地下部和成熟種子中的鋅、鐵含量提高[10]。擬南芥中發現的多種ZIP家族基因中AtIRT2主要在根部表達，定位在囊泡，推測具有細胞內過量金屬元素的解毒功能[11-12]。OsIRT1參與鎘的運輸，并且OsIRT1過表達材料提高了植株對過量鋅和鎘的敏感性[13]。在缺銅誘導下，AtZIP2和AtZIP5在根部表達[14]，證明這2個基因都參與了Cu2+的轉運。研究轉運蛋白功能時，一般情況下，同源基因具有類似的轉運模式的可能性比較大，但在ZIP家族中，由于其他物種與水稻生存環境的差異或者其他因素，造成同源基因的功能存在差異，例如OsZIP8受鋅誘導表達，過表達后會導致鋅在水稻體內再分配，但在擬南芥中，ZIP8轉運蛋白對鋅，鐵，錳，銅可能都無轉運活性[15]。AtZTP29定位在內質網膜上，內質網膜在鹽脅迫下會產生未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，AtZTP29在參與響應鹽脅迫的過程中，是通過調節UPR所需的鋅離子而產生作用[16]。

本研究克隆了小麥TaZIP29-7B基因，并利用生物信息學軟件以及在線分析，對此基因的相關信息及其編碼蛋白進行初步分析，并對啟動子區順式作用元件做一個簡單的預測，再利用實時熒光定量PCR技術分析TaZIP29-7B基因在不同重金屬溶液處理下，其在根系及地上部分的表達特征，為進一步發掘探索該基因的功能機制做出預測。

1 材料與方法

1.1 材 料

小麥‘西農538’由西北農林科技大學農學院高翔老師課題組提供。挑出殘缺的種子，用清水洗去雜質，用質量分數為1%的H2O2處理10 min，再用體積分數為70%酒精消毒處理5 min，再用蒸餾水沖洗4次，沖洗干凈，加水室溫下放置萌發，待種子萌發露白時期，選取部分擺放至鋪有濾紙的培養皿中，放置恒溫培養箱中。待其生長至兩葉一心期時，給予含有重金屬的溶液的處理，然后置于室溫光照條件下培養。重金屬種類為鋅、鐵、銅、鎘，質量濃度設置為200 mg/L，分別處理1、3、6、12、24 h。取葉片及根系樣品后及時用液氮處理，并保存于-80 ℃備用。

1.2 RNA提取及其cDNA第一鏈合成

利用試劑盒RNAprep Pure Plant Kit(天根，北京)提取RNA后，然后檢測所提取的RNA的完整性后，再通過測定濃度的儀器NanoDropTM One(Thermo Scientific，美國)檢測所提取的RNA濃度，最后再使用試劑盒Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)進行cDNA合成。

1.3 TaZIP29-7B 基因及其啟動子克隆

根據NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的擬南芥AtZTP29基因(GenBank登錄號:AT3G20870)序列在在線網站Ensembl Plant(http://plants.ensembl.org/index.html)進行比對，將得到的結果利用引物設計軟件Primer設計特異性引物T25-F、T25-R(表1)，以‘西農538’ cDNA為模板進行擴增，PCR體系和程序設置根據2×EsTaqMasterMix(康為世紀，北京)的說明書進行設計，循環數為32，退火溫度為67 ℃，延伸時間1 min，體系15 μL，產物4 ℃下保存。凝膠電泳檢測條帶大小正確后進行PCR產物回收，并和克隆載體pEASY-T1(全式金，北京)進行連接，轉化大腸桿菌，涂至漢卡那抗生素的LB固體培養基中，37 ℃條件下倒置培養。挑取單克隆菌落，菌液PCR檢測條帶大小正確后，在含卡那(50 mg/L)抗生素的液體培養基中過夜培養后，送公司進行測序，測序結果進行在線比對分析以及利用軟件DNAman進行相關分析。

利用在線網站Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)上尋找TaZIP29-7B基因的上游2 500 bp左右大小的序列，并設計特異性引物Q1-F和Q1-R(表1)進行擴增。PCR體系和程序設置根據2×EsTaqMasterMix(康為世紀，北京)的說明書進行設計，循環數為32，退火溫度為66 ℃，延伸時間2 min，體系15 μL，產物4 ℃下保存。利用在線軟件Promoter 2.0 Prediction Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)在線預測啟動子區，以及PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 對啟動區的預測結果進行進一步關于其順式調控元件的分析。

1.4 TaZIP29-7B 基因生物信息學分析

利用NCBI ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線工具對目的基因的ORF進行分析和并查找該基因的編碼蛋白，利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線對該基因編碼的蛋白保守結構域預測，使用軟件Bioedit、ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)、SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)、CBS-TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進行編碼蛋白的理化性質以及親水性/疏水性以及對蛋白質三級結構的預測和亞細胞定位預測分析，通過TMpred(https://embnet.vital-it.ch/cgi-bin/TMPRED_form_parser)在線分析蛋白質的跨膜區。利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對目的基因的外顯子-內含子結構進行預測分析。最后通過NCBI-Blastp程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對TaZIP29-7B基因編碼氨基酸的同源性進行分析，然后下載不同植物的ZIP蛋白序列信息，并運用ClustalX軟件對該基因的氨基酸序列和其他物種鋅鐵轉運蛋白的氨基酸序列進行多重比對，并利用軟件MEGA6.0構建系統進化樹。

1.5 TaZIP29-7B 基因表達分析

根據所得序列結果設計熒光定量引物QRT4-F,QRT4-R以及內參基因Nc-F,Nc-R(表1)。利用熒光定量儀QuantStudioTM7 Flex(ABI Q7，美國)進行qRT-PCR，體系及程序設置參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus) (TaKaRa，日本)說明書進行，體系20 μL，循環數40，退火溫度 60 ℃，時間32 s。實驗設置3次重復，以保證準確性。利用2-ΔΔCT法計算TaZIP29-7B基因的相對表達量。

表1 引物信息Table 1 Primers information

2 結果與分析

2.1 TaZIP29-7B 基因的獲得及基本分析

2.1.1TaZIP29-7B基因的分析 以‘西農538’的cDNA為模板，以特異性引物T25-F，T25-R進行擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，得到1 000 bp左右出現目的條帶，進行切膠回收后，連接轉化并測序，得到序列長度為896 bp的序列片段，利用NCBI ORF Finder在線比對分析得到834 bp大小的基因編碼區。將所得目的條帶的序列命名為TaZIP29-7B，并提交到NCBI數據庫中，獲得其反饋的序列登錄號：MK203894。利用GSDS 2.0對TaZIP29-7BcDNA基因序列與基因組DNA序列進行比對后分析結果顯示，該基因含有10個外顯子和9個內含子(圖2)。

2.1.2TaZIP29-7B基因編碼蛋白的分析 NCBI-ORF對TaZIP29-7B基因的ORF進行了預測，得到一段長834 bp的ORF，編碼277個氨基酸。ExPASy-ProtParam對蛋白的理化性質分析得到蛋白不穩定指數為40.45，此種蛋白不穩定，理論等電點6.30，總平均親水性0.715，是一種疏水性蛋白(圖3)。根據TargetP 1.1 在線分析反饋結果可知，目的蛋白TaZIP29-7B蛋白定在細胞膜上，屬于分泌通路蛋白，通過SignalP 4.1對TaZIP29-7B蛋白進行信號肽分析，結果顯示目的蛋白存在信號肽，屬于分泌蛋白，與TargetP 1.1分析結果相符合。SMART蛋白的保守結構域預測，得到一個位于目的蛋白第89～263位置間的結構功能域ZIP，屬于典型的ZIP超級家族結構域，參與金屬離子的跨膜轉運，對植物體內的金屬離子的積累和平衡有著重要的作用，符合預期結果。蛋白質三級結構分析結果如圖4所示，含有多個α螺旋，TMHMM分析結果顯示(圖5)，此蛋白有8個跨膜區，在第三到第四跨膜區之間，存在一個位于細胞內的可變區，這一部分區域含有的完全保守的組氨酸殘基，可能與金屬離子的結合與運轉有關。

M. Trans 2K DNA marker;1.TaZIP29-7BcDNA擴增產物 The amplicon ofTaZIP29-7Bfrom cDNA;；2.TaZIP29-7B啟動子擴增產物 The amplicon ofTaZIP29-7Bpromoter

圖1TaZIP29-7B基因PCR擴增產物的電泳結果
Fig.1 PCR amplification ofTaZIP29-7Bgene detected by agarose gel electrophoresis

圖2 TaZIP29-7B 基因結構分析Fig.2 Structure analysis of TaZIP29-7B gene

圖3 蛋白質疏水性分析結果Fig.3 Protein hydrophobicity analysis results

圖4 蛋白質三級結構預測圖Fig.4 Protein tertiary structure prediction map

2.1.3 進化樹構建 利用MEGA 4.0對將山羊草(XP_020178053.1)、二穗短柄草(XP_010234219.1)、烏拉爾圖小麥(EMS47420.1)、玉米(XP_008644450.1)、小米(XP_004972374.1)、糜子(RLM61625.1)、粳稻(XP_015649148.1)等植物的ZIP同源蛋白與TaZIP29-7B蛋白進行比對分析，比對分析結果顯示(圖6)，不同植物之間的鋅鐵轉運蛋白具有高度的同源性，相似度 89.94%～100%，而與小麥的同源蛋白高度一致，是具有高度保守性的。差異較大部分主要體現在第三與第四跨膜區間胞內部分的可變區，但是相同點在于此處范圍內具有組氨酸。可變區內的組氨酸是和金屬離子的結合以及轉運有關的。在與其它科屬的植物的鋅鐵轉運蛋白比對的結果中同樣發現具有較大的相似性在67.87%～70.76%，所以在不同植物之間是存在較大差異的，但是其所行使的作用是基本相似的。利用MEGA6.0采用的NJ法進行進化樹構建(圖7)，分析結果表明，本研究得到的TaZIP29-7B蛋白與山羊草、烏拉爾圖小麥、二穗短柄草的親緣關系最近。

圖5 跨膜區分析結果Fig.5 Transmembrane region analysis results

紅色方框代表ZIP家族獨特的氨基酸殘基 Red squares represent unique amino acid residues in the ZIP family；Ta.小麥TriticumaestivumL.；Aet. 山羊草Aegilopstauschiisubsp.tauschii；Bd. 二穗短柄草Brachypodiumdistachyon；Zm.玉米Zeamays；Si.小米Setariaitalica；Pm.糜子Panicummiliaceum；Os.粳稻OryzasativaJaponica Group；Tu.烏拉爾圖小麥Triticumurartu

圖6 小麥TaZIP29-7B不同植物間ZIP同源蛋白比對結果
Fig.6 Sequence alignment of amino acid residues of TaZIP29-7B with other related proteins

2.2 啟動子克隆及其預測結果分析

以‘西農538’的cDNA為模板，以Q1-F/Q1-R為引物得到TaZIP29-7B基因的上游序列，測序結果比對正確后，再次電泳檢測(圖1)，對所得序列進行啟動子區的分析，得到起始密碼子上游 1 600 bp的序列為啟動子區，轉錄起始位點預測結果顯示含有4個位點(圖8)。利用PlantCARE對啟動子作用元件進行分析，分析結果發現(圖9)，除了啟動子中常見的多種順式作用元件如CAAT-box，TATA-box外，還發現其含有多種與抗逆相關的作用元件，例如參與脫落酸反應的元件ABRE，參與赤霉素反應性的順式作用元件TATC-box，參與MeJA(茉莉酸甲酯)反應性的順式作用調節元件TGACG-motif，還有依賴ABA的MYC和MYB作用元件，參與干旱誘導的MYB結合位點MBS，常見的應激反應元件STRE，以及還發現多種參與光響應的順式作用調節元件如Sp-1、G-Box、chs-Unit 1 m1。

TaZIP29-7B 基因的編碼蛋自 The deduced proteins of TaZIP29-7B gene obtained in this study.

加粗字符表示預測的轉錄起始位點 Bold characters indicate predicted transcription start sites

2.3 TaZIP29-7B 基因表達結果分析

小麥苗期在4種不同重金屬，相同的濃度條件下，在處理不同時間后，最終的檢測結果表明TaZIP29-7B在根和葉組織中均有表達，但表達量不一致。

小麥苗在200 mg/L CdCl2、CuSO4溶液處理下(圖10-A,B)，根系TaZIP29-7B基因表達量呈現出相同的變化趨勢，在1 h內迅速上升，然后在其后的23 h內，TaZIP29-7B的表達量表現出波浪形的變化，并在24 h達到第三個峰值，表達量與對照組相比，大概為兩倍的差異，而出現這種變化趨勢，可能與其體內重金屬離子的動態平衡有關。在ZnSO4溶液處理下(圖10-C)，TaZIP29-7B表達量迅速升高，在3 h時表達量降低到開始一般的水平，在12 h時達到第二個頂峰，在不間斷的處理下，表達量隨后又下降到最低的水平，基本與對照組相同。在FeSO4溶液處理下(圖10-D)，TaZIP29-7B的表達量并沒有像其他3種處理條件下的迅速升高，而是不斷上升，在6 h時達到頂點，隨后又緩慢下降，上升與下降的速率基本相似，但是最后的表達量依舊是高于對照組。相比鋅離子處理下的反應，鐵離子的處理下TaZIP29-7B基因的表達量并不是很迅速，猜測原因在于TaZIP29-7B蛋白與鋅離子的親和性比與鐵離子的要大，所以在鋅離子處理3 h后其體內的TaZIP29-7B表達量就迅速降低的與對照組一致的水平。也能進一步推測鋅離子和鐵離子在植物體內的變化情況，鋅離子能夠較快吸收并迅速達到動態平衡，而TaZIP29-7B基因針對鐵離子的響應則較為緩慢。

圖9 TaZIP29-7B啟動子序列預測元件分析Fig.9 Predicted cis-elements in the promoter of TaZIP29-7B

在與上述溶液相同濃度的條件下，經CdCl2，ZnSO4溶液分別處理小麥苗后(圖11-A,B)，葉片內TaZIP29-7B基因的表達量變化趨勢呈現一致，先迅速升高，隨后在3 h后迅速降低，然后又在6 h時達到2個處理下的最大值，然后又一次緩慢降低，最終在24 h時處在一個較低的表達量時期。由于鎘離子的毒害較大，在24 h時植株的表型已經明顯表現出其生長生理代謝嚴重受損，從而在24 h時TaZIP29-7B基因表達量直接降低到與對照組相同的水平。

在FeSO4、CuSO4溶液處理下(圖11-C,D)，葉片中TaZIP29-7B基因表達量的變化趨勢呈現出完全相反的狀態，在FeSO4溶液處理下，表達量隨著時間的增加而緩慢增大，在6 h時處在最高峰值，隨之下降，但是在24 h時TaZIP29-7B基因表達量依舊是高于對照組的，而在CuSO4溶液處理的過程中，TaZIP29-7B基因表達量先是緩慢下降，直到在6 h時達到最低值，而后又一路升高，在24 h時達到此種處理下的峰值，并且較對照組的表達量高出一倍有余，也證明了TaZIP29-7B蛋白參與了Cd2+、Cu2+的轉運。

3 討 論

在重金屬脅迫下，小麥的生長受到嚴重影響，細胞膜系統會首先受到損傷，但如果其他對植物生長具有重要作用的離子過量，依舊會對小麥的正常生長產生不良影響。本研究成功克隆出小麥TaZIP29-7B基因，并對其編碼的蛋白質結構及功能進行了預測。結果顯示，該蛋白具有ZIP家族高度保守結構域，也因此推斷其具有鋅鐵轉運功能，能夠在體外環境重金屬離子含量出現變化導致基因表達量的變化。在對TaZIP29-7B基因編碼蛋白的功能預測出分析中發現，在第三和第四跨膜區間的可變區內存在高度保守氨基酸殘基組氨酸，該區可能與金屬離子的結合、轉運有關，并且在第五跨膜區內也發現了ZIP家族所具有的高度保守的氨基酸殘基組氨酸，該組氨酸殘基能夠與保守的第V跨膜域形成α螺旋，是膜內Zn2+的結合位點[17]，因此TaZIP29-7B基因編碼蛋白屬于ZIP蛋白家族。在進化樹的構建過程中，對氨基酸序列進行了同源性比對分析，整個進化樹分為單子葉植物和雙子葉植物兩部分，而TaZIP29-7B與單子葉植物中的遺傳距離很近，而雙子葉植物的較遠，也說明TaZIP29-7B基因在長久的進化過程中是比較保守的。

A～D.相同質量濃度但不同重金屬溶液 CdCl2、CuSO4、FeSO4、ZnSO4處理下TaZIP29-7B基因在根系中的表達模式 The expression patterns ofTaZIP29-7Bgene in roots treated respectively with the same concentration of CdCl2, CuSO4,ZnSO4and FeSO4；CK.未經重金屬溶液處理的幼苗 Seedlings without treatment of heavy metal solution；下同 The same below

圖10 根系TaZIP29-7B基因實時定量PCR分析結果
Fig.10 Expression analysis ofTaZIP29-7Bgene by qRT-PCR

圖11 葉片 TaZIP29-7B 基因實時定量PCR分析結果Fig.11 Expression analysis of TaZIP29-7B gene by qRT-PCR

ZIP轉運蛋白除了對植物生長所必須的營養元素如鋅和鐵具有轉運功能外，還參與轉運一些有害于植物的重金屬如鉛、鎘、鎳等。因此在除過鋅、鐵2種重金屬離子溶液的處理下，TaZIP29-7B基因表達量對其余2種鎘銅溶液的處理下依舊出現了相應的變化，并且在根部和葉片中表達量出現差異性，說明TaZIP29-7B蛋白不單單只對鋅鐵離子具有專一的調控作用。在處理的不同時間內，TaZIP29-7B基因表達量也有著明顯的差異，說明TaZIP29-7B基因對鎘離子、銅離子對小麥產生毒害的過程中起著一定的調控作用，但是在重金屬離子濃度過高并且處理時間過久時，會引起葉綠素含量降低，光合作用受阻，氧化酶系統功能紊亂，核酸和蛋白質變性，可溶性糖和淀粉合成受阻[18-20]，生理生化代謝功能受到嚴重影響，從而致使植株生長受抑制最終死亡。

研究ZIP蛋白在植物生長過程中所起的作用，無論是在正常的生產中還是在具有重金屬污染下的環境中的生產，都有一定的意義。在以往的研究中表明，AtZIP1、AtZIP5,AtZIP9,AtZIP12和AtIRT3受缺鋅誘導，由此可推測，這些基因在缺鋅條件下可能增強鋅的吸收能力[21]，例如在野生二粒小麥中克隆的TdZIP1為缺鋅誘導的鋅轉運體，過表達TdZIP1導致鋅在細胞內的積累產生細胞毒性[22]，但是在對重金屬脅迫下的功能并無研究。由于不同金屬離子處于動態平衡之中，互相影響，一種元素的變化會影響到一些轉運蛋白的表達變化，最終導致金屬離子含量變化[13]。ZIP家族在參與多種金屬離子運輸過程中起著重要的作用，包括一些對植物具有毒害作用的金屬離子，同樣受到ZIP轉運蛋白的調控。正常環境中，它對植物生長過程中促進金屬離子的吸收起到良性的積極作用，而在含有毒性重金屬離子的土壤環境里，其又會調節體內金屬離子濃度，起到保護植物正常生長的作用。鑒于TaZIP29-7B蛋白在對重金屬脅迫下所展現的作用，TaZIP29-7B基因在今后小麥育種研究中，可以視其為一個在鹽脅迫方向能被重點利用的基因。如果更進一步的深入研究ZIP轉運蛋白的轉運機制及其在影響籽粒中金屬離子的積累規律，將有助于人們達到改善現有品種以富集金屬離子或降低植株對有害重金屬吸收和積累的目標。