高順式占比番茄紅素納米結構脂質載體的制備及貯藏穩定性研究

熊文慧，姜 欣，孫清瑞，張 建，張連富,

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122； 2.國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122； 3.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319; 4.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832003)

番茄紅素是一種天然的具有生理活性的類胡蘿卜素，有較強的抗氧化性，具有降低癌癥和動脈粥樣硬化發病風險、抑制前列腺良性增生等多種生理功能[1-2]。從結構上看，番茄紅素是一種共軛烯烴，分子中含有11個碳碳共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵[3-4]，存在大量的同分異構體。研究表明，順式構型的番茄紅素比天然存在的全反式番茄紅素更容易被人體吸收，吸收效率達到(4～5)∶1[5]。

番茄紅素的疏水結構使其在食品應用中受到限制，構建油水穩定體系對改善番茄紅素在水基食品中的應用非常關鍵?，F有的番茄紅素水分散性改造方法包括微乳技術[6]、固體脂質納米技術(SLN)[7]、納米結構脂質載體(NLC)技術[8]等。相比較而言，NLC技術作為一種新型脂質包埋納米技術比較適合用于改善番茄紅素的水分散性。孫清瑞[5]、劉會曉[9]等研究建立了以單硬脂酸甘油酯和中鏈甘油三酯為固液脂，Tween80為乳化劑的番茄紅素納米結構脂質載體穩定體系，成功解決了較高載量(4%)的番茄紅素納米結構脂質載體的穩定性問題，由于其選用Tween80作為乳化劑，產品風味欠佳，消費者接受程度受到影響。

針對上述問題，本文嘗試篩選酪蛋白酸鈉、乳清分離蛋白、Quillaja saponin(Q-Naturale)等天然乳化劑作為Tween80的替代，同時從改善產品生理功能角度，嘗試以高順式占比番茄紅素作為包埋對象，優選富含ω-3多不飽和脂肪酸的功能性油脂作為NLC體系的液態脂，制備口味更佳、功能性更強的高順式占比番茄紅素的NLC穩定體系，為類胡蘿卜素等功能性色素的應用提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

番茄紅素標準品(純度≥98%)，華北制藥廠；番茄紅素(順式構型占比為69.82%)，國家功能食品工程技術研究中心番茄紅素課題組提供；硬脂酸甘油酯(GMS，熔點56～58℃)、棕櫚酸甘油酯(熔點63℃)、山崳酸甘油酯(熔點65～77℃)、Tween80，國藥集團化學試劑有限公司；牛油(熔點40～46℃)、牡丹籽油、亞麻籽油、紫蘇籽油、藻油，市售；酪蛋白酸鈉(CA)、乳清分離蛋白(WPI)，無錫盛世宏程生物科技有限公司；Quillaja saponin(Q-Naturale)，宜瑞安食品配料有限公司；其他試劑均為分析純。

Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度儀，英國Malvern公司；高效液相色譜儀，北京創新通恒科技有限公司；AH 2010 高壓均質機，ATS 工業系統有限公司(上海)； 高速剪切機，德國IKA 公司；電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EBA20/20S離心機，德國Hettich公司；UV-2802型紫外可見光分光光度計，尤尼柯(上海) 科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高順式占比番茄紅素納米結構脂質載體(cis-Lyco-NLC)的制備

采用熔融-預乳化和高壓均質聯用法[9]。稱取高順式占比番茄紅素(cis-Lyco)0.3 g，總脂質(固態脂與液態脂質量比3∶1)7.5 g，于85℃加熱形成均一的油相，將100 mL質量濃度為3 g/100 mL的乳化劑溶液加熱至75℃后與油相混合，并在300 r/min下攪拌1 min，隨后將混合液經高速剪切(16 000 r/min)形成預乳液，預乳液經高壓均質(100 MPa，3 循環)后快速冷卻至室溫，得到cis-Lyco-NLC，于冰箱(4℃)保存待分析。

1.2.2cis-Lyco-NLC中番茄紅素總量的測定

稱取番茄紅素標準品2.5 mg，用一定量乙酸乙酯完全溶解后定容于50 mL棕色容量瓶中，得到50 μg/mL的標準母液。分別移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL標準母液定容到10 mL棕色容量瓶中，得到質量濃度梯度為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μg/mL的系列標準溶液。采用高效液相色譜(HPLC)分析，利用峰面積歸一化法確定番茄紅素及其異構體的含量。以番茄紅素質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到番茄紅素的標準曲線方程為y=108 848x-72 073(R2=0.999 9)。其中HPLC分析條件為：YMC carotenoid 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；等度洗脫，流速1.0mL/min；流動相V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(甲基叔丁基醚)為27∶23∶50；柱溫25℃；檢測波長471 nm；進樣量20 μL。

移取100 μLcis-Lyco-NLC樣品，用等體積的無水乙醇破乳后，用乙酸乙酯定容于10 mL棕色容量瓶中，按照上述HPLC分析條件對樣品進行檢測，再通過番茄紅素的標準曲線方程計算樣品中番茄紅素的總量。

1.2.3cis-Lyco-NLC包封率和載量的測定

采用有機溶劑萃取法測定游離番茄紅素含量。移取一定量cis-Lyco-NLC樣品，加入3 mL正己烷，旋渦振蕩30 s后，在3 000 r/min的條件下離心60 s，收集上清液，沉淀再次加入3 mL正己烷，進行上述重復操作3次，合并上清液，定容于10 mL棕色容量瓶中，在471 nm處測定吸光度。以正己烷溶解的番茄紅素標準品的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到番茄紅素標準曲線方程為y=0.200 3x-0.004(R2=0.999 5)。對照標準曲線方程計算樣品中游離番茄紅素含量。按下式計算cis-Lyco-NLC樣品的包封率和載量。

包封率=(番茄紅素總量-游離番茄紅素量)/番茄紅素總量×100%

載量=番茄紅素總量/總脂質含量×100%

1.2.4cis-Lyco-NLC樣品平均粒徑和電位的測定

移取cis-Lyco-NLC樣品10 μL，用10 mmol/L pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至10 mL以防止多重散射的影響。將稀釋后的樣品放入電位池中，采用Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度儀測定樣品的電位；隨后將樣品放入聚苯乙烯比色皿(折光指數1.33)中，采用配有He/Ne激光器(λ=633 nm)的Nano-ZS90型激光粒度儀，在散射角173°、溫度25℃的條件下測定樣品的平均粒徑。通過樣品在45℃下貯藏10 d平均粒徑和電位的變化分析樣品的物理穩定性。

1.2.5cis-Lyco-NLC樣品化學穩定性的測定

已有研究表明，樣品中類胡蘿卜素的降解與顏色變化之間有良好的相關性[10]。本文利用色差計測定cis-Lyco-NLC樣品在45℃下貯藏10 d的顏色變化來比較樣品的化學穩定性。在室溫條件下將10 mLcis-Lyco-NLC移到培養皿中進行顏色測定。

色差計根據CIE顏色體系測定樣品的顏色坐標L*值、a*值、b*值。其中L*值表示顏色的亮度(黑色L*值為0，白色L*值為100)，a*表示紅綠差異(a*值越大，紅色越深)，b*表示黃藍差異(b*值越大，黃色越深)。使用下式計算總顏色的變化ΔE。

1.2.6cis-Lyco-NLC樣品貯藏穩定性的測定

分別將cis-Lyco-NLC樣品注滿并密封保存于30 mL的棕色樣品瓶中，隨后置于-18、4、25、45℃的條件下避光貯藏35 d，測定樣品中番茄紅素保留率及平均粒徑的變化。番茄紅素保留率按下式計算。

保留率=產品貯藏一段時間后番茄紅素含量/產品初期番茄紅素含量×100%

2 結果與分析

2.1 cis-Lyco-NLC中固液脂的篩選

采用不同熔點的固態脂(牛油、GMS、棕櫚酸甘油酯、山崳酸甘油酯)，分別與富含ω-3多不飽和脂肪酸的功能性油脂(藻油、紫蘇籽油、亞麻籽油、牡丹籽油)組合構成固液脂，利用Tween80作為乳化劑制備cis-Lyco-NLC樣品，測定包封率、載量、平均粒徑，同時觀察制備的cis-Lyco-NLC樣品中番茄紅素在液面的漂浮程度以篩選合適的固液脂組合，結果見表1。

表1 不同固液脂組合制備cis-Lyco-NLC樣品的情況

注：番茄紅素的漂浮程度是指放置在樣品瓶中樣品表面番茄紅素的漂浮情況，*表示番茄紅素的漂浮程度，*越多，樣品表面番茄紅素漂浮的量越多。

由表1可知，固態脂的種類對cis-Lyco-NLC樣品的平均粒徑、包封率、載量影響較大，而液態脂只有藻油對樣品的影響較大。這可能是因為藻油中含有豐富的長鏈不飽和脂肪酸，二十二碳六烯酸(DHA)含量較高[11]，而亞麻籽油、紫蘇籽油、牡丹籽油中的不飽和脂肪酸主要是α-亞麻酸，化學組成相近[12-13]。在使用熔融-預乳化方法制備cis-Lyco-NLC時，液態脂的熔融效果相同，固態脂由于熔點和物理性質的不同使得制備的cis-Lyco-NLC樣品之間存在較大差異。GMS和牡丹籽油作為固液脂組合制備的cis-Lyco-NLC樣品包封率高達92.10%，載量為3.68%，且表面無明顯的番茄紅素漂浮，樣品平均粒徑為212.61 nm，有利于維持樣品穩定。因此，選擇的最佳固液脂組合為GMS和牡丹籽油。

2.2 cis-Lyco-NLC中乳化劑的篩選

選定GMS和牡丹籽油為最適固液脂組合，Tween80、CA、Q-Naturale、WPI作為乳化劑，按照1.2.1的方法制備cis-Lyco-NLC樣品，考察乳化劑對cis-Lyco-NLC樣品物理化學穩定性的影響，篩選最適的乳化劑。

2.2.1 不同種類乳化劑對cis-Lyco-NLC樣品貯藏期間物理穩定性的影響

圖1為不同種類乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品在貯藏過程中平均粒徑的變化情況。

圖1 乳化劑種類對cis-Lyco-NLC平均粒徑的影響

由圖1可見，乳化劑對cis-Lyco-NLC樣品的平均粒徑有很大的影響，不同種類乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品在貯藏初期平均粒徑都相對較小(<500 nm)，有利于防止液滴聚集和維持樣品穩定。貯藏過程中由Q-Naturale作為乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品平均粒徑明顯增加，表明樣品發生了某種形式的液滴聚集，如絮凝或聚結。這可能是在均質過程中沒有足夠的Q-Naturale覆蓋液滴表面，造成樣品中液滴的絮凝和合并[14]。WPI作為乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品平均粒徑在貯藏前期維持不變，貯藏后期略有增加，這可能是隨著貯藏時間的延長，液滴發生了部分絮凝導致平均粒徑增大。在貯藏期間Tween80制備的樣品平均粒徑先增加后減少，可能是經過較長時間的貯藏后在樣品頂部形成單獨的油相而與體系分離，最終僅在原樣品中保持較小的液滴，從而導致平均粒徑明顯減小[15]。CA作為乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品由于液滴間的空間排斥作用在貯藏期間平均粒徑基本維持不變，乳液穩定性好[16]。

圖2為不同種類乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品在貯藏過程中電位的變化情況。

圖2 乳化劑種類對cis-Lyco-NLC電位的影響

由圖2可見，不同種類乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品在貯藏初期電位特征明顯不同，由Q-Naturale、WPI、CA制備的樣品有很高的電負性，電位在-35 mV左右，而由Tween80制備的樣品電位為-16 mV。WPI、CA等蛋白制備的cis-Lyco-NLC樣品具備高電負性是因為樣品的pH高于蛋白質的等電點(PI約為5.6)，表面存在額外的羧基使得樣品帶有較高的負電位[17]。而由Q-Naturale制備的cis-Lyco-NLC樣品因其在中性條件下存在帶電荷的羧基而呈高電負性[14]。Tween80作為一種非離子表面活性劑，幾乎不帶電，但是已有研究表明Tween80在中性條件下會因為吸附水中的氫氧根離子而帶適當的電負性，或者由于牡丹籽油中的雜質(如游離脂肪酸)等陰離子的存在，使其可能在中性條件下具有明顯的負電荷，帶適當的電負性[15]。不同種類乳化劑制備的樣品在貯藏9 d后電位大小都有一些變化，這表明貯藏過程中界面組成可能有一些變化。貯藏期間測定不同種類乳化劑制備樣品的平均粒徑和電位變化發現，CA作為乳化劑制備的樣品在貯藏過程中平均粒徑沒有明顯的變化(圖1)，且始終維持高電負性來抑制液滴聚結和絮凝[18-20]。因此，與其他乳化劑相比，CA作為乳化劑制備的樣品物理穩定性最好。

2.2.2 不同種類乳化劑對cis-Lyco-NLC樣品貯藏期間外觀變化的影響

觀察不同種類乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品在45℃貯藏10 d前后的外觀變化發現，Tween80作為乳化劑制備的樣品在貯藏10 d后樣品顏色由橙紅變為淡黃，Q-Naturale和WPI作為乳化劑制備的樣品在貯藏10 d后樣品顏色變化較小，樣品顏色仍為橙色，CA作為乳化劑制備的樣品依然表現為較強的橙紅色，并且在貯藏后看起來是均勻的，表明沒有發生液滴聚集。另一方面，在Tween80和WPI作為乳化劑制備的樣品頂部存在明顯的黃色層，貯藏10 d后表面有油上浮。

2.2.3 不同種類乳化劑對cis-Lyco-NLC樣品化學穩定性的影響

圖3為不同種類乳化劑制備的cis-Lyco-NLC樣品在貯藏過程中顏色變化情況。

由圖3A可見，在貯藏期間，CA、WPI以及Q-Naturale作為乳化劑制備的樣品亮度(L*)變化不大，表明在這些體系中油滴的光散射效率沒有明顯變化[21]。相反，由Tween80制備的樣品亮度在貯藏期間明顯增加，這可能主要是由于體系中顏色吸收急劇下降(特別是a*值)所致。由圖3B和圖3C可見，貯藏初期，cis-Lyco-NLC樣品都具有較高的a*值(約40)和b*值(約52.5)，具有黃紅色外觀。貯藏期間，所有樣品的a*值逐漸降低，表明紅色變淺，其中Tween80制備的樣品a*值比其他3種體系降低得更明顯，所有樣品在貯藏過程中b*值均有升高，表明樣品中番茄紅素在貯藏期間有所降解。由圖3D可見，在貯藏期間所有樣品的彩度均發生了不同程度的變化。WPI和Q-Naturale作為乳化劑制備的樣品ΔC*值變化程度大致相同(1.5～6)，CA作為乳化劑制備的樣品ΔC*值變化最小(0.6～3.3)，而Tween80作為乳化劑制備的樣品ΔC*值變化顯著(1.5～12.4)。由圖3E可知，所有樣品在貯藏期間總顏色均發生了變化。CA制備樣品的ΔE值由1.7增加到4.0，抑制總顏色變化最有效，Tween80作為乳化劑制備的樣品ΔE值由1.8增加到16.3，抑制樣品總顏色變化效果最差，而WPI和Q-Naturale抑制樣品總顏色變化效果一般，ΔE值由1.8增加到7左右。結合物理穩定性實驗結果可知，由CA作為乳化劑形成的界面層可以保護cis-Lyco-NLC樣品免于聚結，cis-Lyco-NLC樣品的物理和化學穩定性最好，且有利于減緩樣品中類胡蘿卜素的降解速度。

2.3 cis-Lyco-NLC樣品的貯藏穩定性

以GMS和牡丹籽油為固液脂，CA為乳化劑，按照1.2.1方法制備cis-Lyco-NLC，所制備樣品的包封率為94.6%，載量為3.72%，平均粒徑為185.63 nm。對所制備樣品的貯藏穩定性進行研究，結果見圖4。

圖4 不同貯藏溫度對cis-Lyco-NLC樣品中番茄紅素保留率的影響

由圖4可知，貯藏溫度對cis-Lyco-NLC樣品中番茄紅素的保留率影響較大，在-18℃或4℃低溫貯藏環境下包埋在NLC中的番茄紅素含量變化不明顯，貯藏35 d番茄紅素保留率仍在90%以上，當貯藏溫度為25℃和45℃時，番茄紅素保留率下降明顯，特別是在45℃時貯藏35 d，番茄紅素保留率下降到60.6%，說明高溫加速了番茄紅素的降解，使得樣品中番茄紅素含量下降。貯藏實驗結果表明，低溫貯藏能有效延緩cis-Lyco-NLC樣品中番茄紅素的降解。

表2列出了在不同貯藏溫度和時間下cis-Lyco-NLC樣品的平均粒徑。

表2 不同貯藏溫度對cis-Lyco-NLC樣品平均粒徑的影響(平均值±SD，n=3)

由表2可知：在4℃貯藏溫度下，樣品的平均粒徑變化較小，貯藏35 d后樣品的平均粒徑從185.63 nm增加到199.65 nm；在25℃貯藏溫度下，貯藏35 d后樣品的平均粒徑從185.63 nm增加到243.76 nm；在45℃貯藏溫度下，樣品的平均粒徑變化更為明顯，貯藏35 d后樣品的平均粒徑從185.63 nm增加到350.48 nm。說明當貯藏溫度升高時，cis-Lyco-NLC樣品中的液滴發生了聚集，造成液滴增大，這與文獻[22-23]報道的其他NLC在貯藏期間平均粒徑的變化一致。原因可能是隨著貯藏溫度升高，粒子的動能逐漸增強，加速液滴間的碰撞使其聚集形成大顆粒。此外，cis-Lyco-NLC樣品在-18℃貯藏溫度下，平均粒徑大幅度增加。可能的原因是在冷凍過程中，樣品形成大量的冰晶，導致液滴聚集使得樣品的平均粒徑增大。通過貯藏實驗結果發現，在4℃的貯藏條件下，有利于維持cis-Lyco-NLC樣品平均粒徑的穩定，且番茄紅素保留率也維持在90%以上。

3 結 論

本文通過篩選富含ω-3多不飽和脂肪酸的液態脂和天然乳化劑制備功能性更強的cis-Lyco-NLC穩定體系。固液脂篩選結果表明，乳化劑為Tween80時，納米結構脂質載體的固液脂組合為GMS和牡丹籽油(固態脂與液態脂質量比3∶1)，所制備樣品的包封率高達92.10%，載量為3.68%，且平均粒徑為212.61 nm，穩定性好。乳化劑篩選結果表明，天然乳化劑CA制備的cis-Lyco-NLC樣品在45℃貯藏10 d后平均粒徑保持在200 nm左右，物理化學穩定性最好。選定固液脂組合為GMS和牡丹籽油(固態脂與液態脂質量比3∶1)、乳化劑為CA制備cis-Lyco-NLC，其包封率為94.6%，載量為3.72%，平均粒徑為185.63 nm，在4℃下貯藏35 d后，cis-Lyco-NLC樣品的平均粒徑始終小于200 nm，番茄紅素保留率在90%以上。