頂空-氣相色譜法測定丁酸梭菌發酵液中短鏈脂肪酸含量

魏琦麟，向 蓉，袁明貴，彭新宇，康樺華，余丹妮，徐志宏

(1.華中農業大學 食品科學技術學院，武漢 430070； 2.廣東省農業科學院動物衛生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農業部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)在厭氧發酵過程中會產生一系列的短鏈脂肪酸(SCFAs)，其代謝產物主要為丁酸和丁醇，乙酸和丙酮是副產物，還有少量的乳酸和乙醇產生[1]。丁酸梭菌在腸道內定植后，主要代謝產生乙酸、丁酸和琥珀酸等[2]，90%以上的SCFAs通過質子化和陰離子擴散的方式被腸上皮細胞吸收，只有5%～10%被排泄到體外[3]。SCFAs不僅可以降低腸道pH，抑制有害菌的生長，還可以作為腸上皮細胞能量代謝和生長發育的重要能量來源，維持腸道健康。SCFAs中的丁酸可以作為配體激活特異性G蛋白偶聯受體，激活腸黏膜免疫活性，在一定程度上起到增強免疫力的作用[4]。因此，丁酸梭菌發酵過程中的代謝產物及其功能作用受到廣泛關注。

生物樣品中SCFAs的分析方法較多，如氣相色譜法(GC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、毛細管電泳法(CE)[8]和離子排斥色譜法(IC)[9]等。Chen等[10]將人體的血液樣品經衍生化處理后，通過液相色譜法測定血液中丁酸和己酸含量，雖然該方法可靠性高，但復雜的前處理操作，導致方法的重現性和簡便性較差。CE和IC由于儀器設備價格昂貴，成本較高，不具有普遍適用性[11-13]。GC具有靈敏度高，分析時間短，無需衍生化處理等優點，是測定生物樣品中SCFAs最常用的方法[14]。樣品一般通過有機溶劑萃取后經濾膜過濾，再進行GC分析，然而由于生物樣品的復雜性，雜質的存在會污染進樣口和毛細管柱，降低分析的準確性，增加維護成本[15]。頂空進樣器(Headspace sampler，HS)是一種廣泛應用于復雜基質樣品中短鏈物質的分析方法[16-17]，在測定生物樣品中的短鏈成分時具有獨特的優勢，避免了非揮發性組分對分析造成的干擾，減少了對色譜柱及進樣口的污染[18]，在很大程度上彌補了以上方法的缺陷。本文建立了HS-GC分析丁酸梭菌發酵液中SCFAs的方法并進行了方法學驗證，以期為生物樣品中SCFAs的測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸和2-乙基丁酸均為色譜純，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

島津GC-2010 Plus氣相色譜儀，配備氫火焰離子化檢測器(FID)；HS-10頂空自動進樣器；Rtx-Wax彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別精確稱取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸標準品，純水定容，配制成200 mmol/L的乙酸、異丁酸、丁酸標準儲備液，100 mmol/L的丙酸、戊酸和己酸標準儲備液，備用。

分別移取不同體積的標準儲備液，配制成混合標準品溶液，其中，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸的終濃度均為20 mmol/L。將標準品混合溶液用純水梯度稀釋成不同濃度，在各濃度混合標準品溶液中加入內標物2-乙基丁酸，使內標物濃度均為1 mmol/L。

1.2.2 丁酸梭菌發酵液的制備

將活化后的丁酸梭菌，按3%的接種量接入發酵培養基中，37℃下厭氧培養。每隔2 h取樣，樣液在5 000 r/min、室溫下離心10 min，將上清液與甲酸以100∶1的體積比混合均勻后取1 mL移入頂空進樣瓶中，同時加入內標2-乙基丁酸，加蓋密封，待測。

1.2.3 HS-GC分析條件

頂空進樣器條件：恒溫爐溫度70℃，樣品流路溫度90℃，傳輸線溫度110℃；樣品瓶加壓氣壓160.0 kPa，樣品瓶恒溫時間10 min，樣品瓶加壓時間1 min，GC循環時間22 min。

GC條件：氫氣和空氣流速分別為60 mL/min和400 mL/min，高純度氦氣流速1.67 mL/min；程序升溫為初溫80℃，以10℃/min升溫至200℃，保持1 min，以20℃/min程序升溫至220℃，保持1 min；進樣口溫度220℃；FID檢測器溫度300℃，分流比1∶10。

1.2.4 方法學驗證

1.2.4.1 標準曲線線性回歸方程與檢測范圍確定

取1.2.1中梯度稀釋的標準品溶液，分別進行GC測定。以標準品濃度為橫坐標，不同濃度下標準品的峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線，并進行擬合得線性回歸方程。

1.2.4.2 日內精密度及日間精密度考察

日內精密度為在同一天內，取同一批分析樣品每隔2 h測定1次，每天連續測定6次。日間精密度為同一樣品連續3 d進行GC測定分析。通過計算各SCFAs色譜峰的保留時間和峰面積的RSD判斷方法的精密度是否符合要求。

1.2.4.3 穩定性考察

將已知濃度的SCFAs混合標準品溶液在4℃下存放，連續3 d取樣，在室溫下進行GC分析，考察溶液在3 d內的穩定性。

1.2.4.4 樣品加標回收率考察

取20 h發酵液樣品，測定其中SCFAs濃度后，分別在發酵液中加入低、中、高3個不同濃度的混合標準品溶液，其中低濃度的加入量為樣品測定濃度的80%，中濃度的加入量與樣品測定濃度相近，高濃度的加入量為樣品測定濃度的120%，按下式計算加標回收率。

加標回收率=(加標試樣測定值-初始量)/加標量×100%

2 結果與討論

2.1 標準品色譜圖(見圖1)

注：1.乙酸；2.丙酸；3.異丁酸；4.丁酸；5.戊酸；6.2-乙基丁酸；7.己酸。

圖1 混合標準品溶液色譜圖

由圖1可見，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸的保留時間分別為4.840、5.779、6.112、6.800、8.057、9.270 min，內標物2-乙基丁酸的保留時間為8.315 min。各SCFAs峰形良好，基線穩定，拖尾較小，各組分的分離度較好，內標物與其他組分間峰位相近且分離度良好，表明該測定方法可以將待測組分很好地分離，適合SCFAs的分離和鑒定。

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線回歸方程與檢測范圍

按1.2.4.1方法，得到各SCFAs的標準曲線回歸方程，如表1所示。

表1 SCFAs的標準曲線回歸方程、檢測限、定量限

由表1可見，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸在相應濃度范圍內標準曲線的線性相關系數均大于0.999，表示在該方法的濃度范圍內，各SCFAs標準曲線的線性關系良好。由信噪比法計算得到檢出限(LOD)范圍為0.01～0.17 mmol/L(S/N>3)，定量限(LOQ)范圍為0.02～0.53 mmol/L(S/N>10)。檢出限與定量限較低，說明該方法可以作為丁酸梭菌發酵過程中SCFAs含量檢測定量方法使用。

2.2.2 日內精密度與日間精密度

按1.2.4.2考察方法的日內精密度和日間精密度，結果分別如表2、表3所示。

表2 日內精密度(n=6)

表3 日間精密度(n=3)

由表2、表3可見，峰面積的日內精密度良好，RSD范圍為0.12%～0.93%，3 d內各標準品峰面積的日間RSD為1.18%～2.86%，保留時間的日內RSD和日間RSD分別為0.01%～0.03%和0.07%～0.45%。說明在試驗期內，各SCFAs的出峰時間穩定，峰面積變化在誤差允許范圍內，有較好的日內精密度及日間精密度。

2.2.3 穩定性

按照1.2.4.3方法考察樣品的穩定性，結果如圖2所示。

圖2 標準品穩定性

由圖2可見，混合標準品中各SCFAs含量的RSD均在8%以下，表明在該條件下各SCFAs在3 d內具有較好的穩定性，說明在3 d內可使用同一樣品進行試驗。

2.2.4 加標回收率

按1.2.4.4方法考察樣品的加標回收率，結果如表4所示。

由表4可見，乙酸和丁酸的加標回收率范圍分別在90.14%～108.71%和88.90%～95.36%之間。表明該方法適用于發酵液樣品中乙酸和丁酸的定量測定。

表4 加標回收率

2.3 樣品分析

丁酸梭菌在發酵培養基中隨時間變化產SCFAs情況如圖3和圖4所示。

圖3 48 h內乙酸含量變化

圖4 48 h內丁酸含量變化

由圖3、圖4可見，應用HS-GC在丁酸梭菌發酵培養基中檢測到乙酸和丁酸兩種SCFAs。接種后的培養基內含有少量的乙酸，在0～14 h時，乙酸和丁酸的含量變化緩慢，14 h開始，進入到二者含量變化的對數期，乙酸和丁酸的含量增加迅速，尤其是丁酸，在15 h左右含量超過了乙酸，成為發酵液中含量最高的短鏈脂肪酸，在22 h時進入乙酸和丁酸含量的穩定期，二者含量分別為10.5 mmol/L和12.5 mmol/L左右，持續到32 h，有小幅度的增長，最終丁酸和乙酸的含量分別穩定在14.1 mmol/L和11.9 mmol/L左右。

2.4 討論

微生物發酵過程中產生的短鏈物質種類較多，且含量變化各不相同，增加了分析測定的難度。在SCFAs檢測過程中，易揮發的性質導致樣品定量不準確、重復性差，同時雜質的存在也會影響樣品峰形及基線穩定。在相關文獻報道中，張小菊等[19]采用同時蒸餾萃取法提取了花生粕混合菌發酵物的短鏈物質，并使用帶有普通進樣器的氣相色譜儀進行短鏈物質的測定。結果顯示，經過同時蒸餾萃取的短鏈物質較少，在樣品中只檢測到少量乙醇，可能的原因是前處理損耗了較多的短鏈成分，另外蒸餾萃取過程中帶有的雜質導致峰形較差并且出峰不明顯。吳慧玉[20]使用乙酸乙酯萃取大腸桿菌發酵液中的SCFAs，建立了氣相色譜分析方法，各SCFAs之間分離度較好，但由于前處理采用有機溶劑萃取法，在前處理過程中無法避免SCFAs的損失，線性相關系數未能大于0.999，同時由于采用乙酸乙酯作為萃取劑，氣相色譜分析過程中會出現較強的溶劑峰，在干擾色譜分析準確性的同時，也產生一定的基質效應。本研究中使用的頂空-氣相色譜分析簡化了前處理過程，減少了樣品中SCFAs在前處理過程中的損失，最大程度地保留了原始組分，檢測結果更加接近樣品中的真實成分，相比于普通進樣分析準確度有所提升，頂空進樣器在避免溶劑峰對分析干擾的同時，也有效減少了有機溶劑對氣相色譜系統的污染，降低了維護成本。檢測結果也顯示各標品曲線的線性關系良好，相應濃度范圍相關系數均大于0.999。方法學驗證顯示本研究建立的方法重復性好、穩定度高。此外，李夢嬌等[21]在對植物油中SCFAs含量分析時所用時間為26 min，Umar[22]對益生菌發酵產物中SCFAs含量分析所用時間為20.5 min，而使用頂空進樣器進行SCFAs含量的測定，分析時間為16 min，明顯縮短了分析測定總時間，且無需樣品前處理，在大批量、快速檢測應用方面具有明顯的優勢，適用于發酵液中SCFAs快速測定。

3 結 論

采用頂空-氣相色譜法分析丁酸梭菌發酵液中SCFAs的含量變化，該方法前處理簡單，避免了有機溶劑萃取過程對環境的污染和對操作人員的危害，色譜峰分離效果好，重復性好，具有快速、準確和穩定性高的特點。所建立的方法適用于丁酸梭菌發酵過程中SCFAs含量的快速測定。