超聲輔助分步結晶法制備高純度豆甾醇的工藝研究

馮文歡，吳正章，張 鵬，常 明，金青哲，王興國

(1.江南大學 食品學院，國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122； 2.江蘇科鼐生物制品有限公司，江蘇 泰興 225400)

植物甾醇是一類以環戊烷全氫菲為基本骨架的天然活性化合物[1]，廣泛存在于各類植物種子、堅果和植物油中，主要包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等。植物甾醇具有降低機體總血清膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[1-2]、降低心臟疾病風險[3]、抗氧化[4]、消炎[5]和抗癌[6]等生理功能。近年來，植物甾醇在食品、醫藥和化工等領域受到廣泛關注，截至2015年全球植物甾醇的需求量高達1.8萬t左右[7]，且以豆甾醇為原料合成的甾體藥物需求量大幅提升[8]。如何有效分離高純度豆甾醇并規?；a，以滿足市場需求具有重要的社會意義和經濟價值。

目前，由于高純度豆甾醇的價格高昂，降低豆甾醇制備成本是工業化生產亟待解決的問題。常見的植物甾醇分離純化方法主要有化學衍生法、色譜法和溶劑結晶法等?；瘜W衍生法將植物甾醇衍生化，增大各甾醇單體間的物性差異后再進行分離，但此工藝步驟煩瑣，成本高且產率低，難以規?；a[9]；色譜法主要利用制備級液相色譜通過優化流動相配比達到分離各甾醇單體的目的，此法色譜純級溶劑消耗量大且制備量小，工業化生產成本高[10-11]；溶劑結晶法利用植物甾醇單體之間顯著的溶解度差異，通過升溫降溫促使飽和溶液體系中豆甾醇率先結晶析出，此法雖結晶次數較多，但制備工藝易于工業化生產且產品純度較高。目前的溶劑結晶法主要采用單一溶劑如環己酮[12]、正戊醇[13]、正丁醇[14]等非極性溶劑進行多次結晶，其純度往往無法再通過增加結晶次數得到更高純度的豆甾醇產品，且豆甾醇得率較低。研究表明：液體介質經超聲處理后，由渦流或超聲波產生的“空化”作用能夠促進晶體成核，提高晶體生長速率并防止晶體聚集，縮短結晶時間并提高結晶產率；而且超聲處理能夠改變晶體粒度，縮短結晶過濾周期，加快晶體干燥速度，大大縮短豆甾醇的生產工藝周期[15-16]。

本文采用超聲輔助分步結晶法，富集階段篩選出環己酮為結晶溶劑，經5次結晶富集得到純度95%左右的豆甾醇粗品；精制階段篩選出丙酮為結晶溶劑，引入超聲輔助處理以提高精制過程中豆甾醇的得率，最終獲得純度99%以上豆甾醇產品。本文通過單因素實驗探究了豆甾醇純化過程中料液比、養晶時間、養晶溫度、超聲時間和超聲功率等條件，為工業化生產高純度豆甾醇提供了解決方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

98%植物甾醇(豆甾醇約占30.9%)，由江蘇科鼐生物制品有限公司提供；正己烷為色譜純，購自百靈威科技有限公司；環己酮、丙酮等試劑及藥品均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化試劑,購自百靈威科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

EL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-300DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；QGC-12T氮氣吹干儀，上海泉島公司；循環水式多用真空泵，上海瀘西分析儀器有限公司；DHX-3015低溫恒溫槽，南京舜瑪儀器設備有限公司；ZK-82BB型電熱真空干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司；GC-MS(ISQ)氣相色譜-質譜聯用儀，Thermo Fisher公司；Nexus傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；AdvanceⅢ 400MW全數字化核磁共振波譜儀，德國布魯克AXS有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆甾醇的富集

取50 g植物甾醇與非極性溶劑按一定配比加至250 mL夾層酶反應器中，連接低溫恒溫槽，開啟循環水浴加熱至65℃，充分攪拌直至樣品完全溶解后，恒溫平衡30 min后降溫至一定溫度，養晶，抽濾，濾餅真空干燥至恒重，稱重。所得晶體用上述方法反復結晶，實現豆甾醇的富集。

1.2.2 豆甾醇的精制

取10 g豆甾醇富集產物與極性溶劑按一定配比加至100 mL圓底燒瓶中加熱至60℃，充分攪拌直至樣品完全溶解后，靜置平衡30 min，置于超聲波清洗器中，保持超聲溫度60℃，用不同的超聲功率處理一段時間后，將圓底燒瓶在一定溫度下靜置養晶，抽濾，濾餅真空干燥至恒重，稱重。將所得晶體用上述方法反復結晶，實現豆甾醇的精制。

1.2.3 豆甾醇純度的測定

樣品預處理：稱取5 mg豆甾醇樣品于10 mL容量瓶，用正己烷稀釋至刻度。取0.1 mL溶液于2 mL離心管內，氮氣吹干溶劑，加入200 μL硅烷化試劑，置于75℃水浴內30 min，過0.22 μm有機濾膜，進樣檢測，依據峰面積歸一化法測定樣品純度。

氣相色譜條件：DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序為200℃保持0.5 min，10℃/min升溫至300℃，保持18 min；檢測器溫度和進樣口溫度均為280℃；進樣量1.0 μL；分流比100∶1；載氣為99.99%氦氣，載氣流速1.2 mL/min；程序運行時間為28.5 min。

1.2.4 豆甾醇得率計算

豆甾醇得率=結晶樣品質量×結晶樣品中豆甾醇的純度/(結晶原料質量×結晶原料中豆甾醇的純度)×100%。

1.2.5 結構鑒定

紅外光譜(FT-IR)：將分離提純制得的豆甾醇充分干燥后，使用KBr壓片法，掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數為32，分辨率為4 cm-1。

核磁(1H NMR)：通過核磁共振譜儀分別對豆甾醇進行氫譜的分析，以氘代氯仿為溶劑，在400 MW條件下進行測定。

1.2.6 數據分析

每組實驗平行測定3次，求平均值，實驗數據以“平均值±標準偏差”表示。使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)計算不同參數下的顯著性差異，P<0.05表示組間數據在0.05水平上存在顯著性差異，以a、b、c表示。

2 結果與討論

2.1 豆甾醇富集工藝的單因素實驗

2.1.1 溶劑的選擇

控制料液比1∶4、養晶溫度25℃、養晶時間24 h，選取正丙醇、正戊醇、異戊醇、環己酮、正丁醇和異丁醇作為結晶溶劑，考察溶劑對豆甾醇富集效果的影響，結果見圖1。

圖1 溶劑種類對豆甾醇純度的影響

由圖1可知，6種溶劑均具備富集豆甾醇的能力，其中環己酮的富集效果最佳，因此選擇環己酮作為豆甾醇富集過程的溶劑。

2.1.2 料液比的選擇

控制養晶溫度25℃、養晶時間24 h，考察不同料液比對豆甾醇純度和得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 料液比對豆甾醇純度和得率的影響

由圖2可知，隨料液比增大，豆甾醇的純度整體呈增大趨勢，當料液比大于1∶3.5時，豆甾醇純度增大不顯著。這是因為溶劑用量越大，結晶體系過飽和度越低，較好的晶體完整性有利于甾醇純度的提升；在料液比小于1∶3.5時，由于體系過飽和度較大，導致晶體產生快速不均勻性生長現象，大量純度較低的晶體析出導致整個體系黏稠，增加結晶抽濾和去除溶劑的難度；而當料液比介于1∶3.5～1∶4時，豆甾醇純度相對于較低料液比時顯著提高且得率仍為57%左右。綜合考慮，選擇1∶3.5為豆甾醇富集的最佳料液比。

2.1.3 養晶溫度的選擇

選取料液比1∶3.5、養晶時間24 h，考察不同養晶溫度對豆甾醇純度和得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 養晶溫度對豆甾醇純度和得率的影響

由圖3可知，豆甾醇純度隨養晶溫度的升高先緩慢提升后降低，得率隨養晶溫度升高而降低，尤其30℃時得率相比于20～25℃時顯著下降約25個百分點。養晶溫度直接涉及是否需要加熱設備，綜合考量純度、得率及溫度對規?；a設備的需求，選取養晶溫度25℃較合適。

2.1.4 養晶時間的選擇

選取料液比1∶3.5、養晶溫度25℃，考察不同養晶時間對豆甾醇純度和得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 養晶時間對豆甾醇純度和得率的影響

由圖4可知，隨養晶時間的延長，豆甾醇純度呈緩慢上升趨勢，而得率先升高再降低。當養晶至16～20 h時，豆甾醇純度和得率均無顯著變化。綜合考慮，養晶時間控制在16 h較為合適。

根據上述單因素實驗結果，得到富集過程最優工藝條件為：以環己酮為溶劑，料液比1∶3.5，養晶溫度25℃，養晶時間16 h。在最佳條件下，經過重復5次富集，制備得到了純度達到94.69%的豆甾醇粗品，并以此粗品為原料進行豆甾醇的精制結晶制備工藝探究。

2.2 豆甾醇精制工藝的單因素實驗

實驗結果表明環己酮作為溶劑無法進一步提高產物純度。據專利[17]報道非極性溶劑體系難以分離純化高純度的豆甾醇，因此通過改變溶劑體系，實現豆甾醇的精制。

2.2.1 溶劑的選擇

控制料液比1∶65、養晶溫度25℃、養晶時間4 h，考察甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、異丙醇5種極性溶劑對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖5所示。

圖5 溶劑種類對豆甾醇純度的影響

由圖5可知，使用甲醇、乙腈和乙醇結晶后的豆甾醇純度降低，無精制效果，異丙醇僅提升豆甾醇純度不足1個百分點，而丙酮能夠顯著提高豆甾醇純度2.5個百分點，起到精制豆甾醇的目的。因此，后續實驗采用丙酮作為溶劑進行豆甾醇的精制。

2.2.2 超聲時間的選擇

圖6 超聲時間對豆甾醇純度和得率的影響

由圖6可知，與未進行超聲處理的實驗組進行比較，豆甾醇得率顯著提高。這是由于超聲波產生的“空化”作用，縮短了從過飽和態到晶核形成并析出晶體之間的誘導期，加快了晶體的生長速率，促使得率顯著提高；同時，“空化”作用產生的空化氣泡能侵蝕剝落晶體外表面的雜質層，降低由于雜質包裹引起晶體的各向生長異性，從而伴隨豆甾醇晶體析出的雜質分子較少，因此純度提高[15]。當超聲時間為3 min時，甾醇純度提升至最高的97.86%，而得率提升至54.30%，繼續延長超聲時間，豆甾醇得率趨于穩定，而豆甾醇純度降低，因此選擇超聲時間為3 min進行后續實驗。

2.2.3 超聲功率的選擇

控制料液比1∶65、超聲時間3 min、養晶溫度25℃、養晶時間4 h，考察不同超聲功率對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖7所示。

圖7 超聲功率對豆甾醇純度和得率的影響

由圖7可知，隨著超聲功率的提高，豆甾醇得率、純度先升高后降低。當超聲功率分別為80、90 W時，豆甾醇純度和得率分別達到最大。這是因為提高超聲功率晶體的粒度減小，晶體粒度減小雖可防止晶體聚結并縮短結晶時間，但過小的晶體粒度也會增加單位晶體的生長時間，從而在相同養晶時間內晶體析出量減少，得率降低[18]，且過小的粒度易重新聚集并包裹雜質，從而導致純度下降。綜合考慮，超聲功率為90 W較合適。

2.2.4 料液比的選擇

控制超聲時間3 min、超聲功率90 W、養晶溫度25℃、養晶時間4 h，考察不同料液比對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖8所示。

圖8 料液比對豆甾醇純度和得率的影響

在結晶體系中，料液比越大，過飽和度越小，溶劑體系更有利于晶核的有序生長，且晶體依附于晶核緩慢生長形成完整性較好的晶體往往純度也較高，但是晶體析出緩慢也是得率偏低的原因之一。反之，高過飽和度增大了體系的傳質阻力，晶體趨于不均勻性生長，雖然晶體的快速析出促使了得率的顯著提高，但雜亂無序的晶體快速生長所包藏的母液、非目標晶體和雜質等也直接導致了純度的較低。由圖8可知，隨著料液比的增大，豆甾醇得率顯著下降，而純度逐步提升后趨于平緩，當料液比為1∶70時，純度達到97.4%左右，且得率并未顯著下降。綜合考慮，選擇1∶70為豆甾醇精制的最佳料液比。

機車無動力回送中，由于其空氣壓縮機無電停止使用，此時必須開放機車無動力裝置。無動力裝置由：DE無動力塞門、DER壓力調整閥、C2充風節流孔、CV單向止回閥等部分組成。

2.2.5 養晶溫度的選擇

控制料液比1∶70、超聲時間3 min、超聲功率90 W、養晶時間4 h，考察不同養晶溫度對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖9所示。

圖9 養晶溫度對豆甾醇純度和得率的影響

由圖9可知，隨養晶溫度升高，豆甾醇純度增大，得率降低。當養晶溫度為15℃時，豆甾醇得率高達68%左右，但其純度僅為96.5%左右，說明溫度過低促使體系溫差擴大，晶體快速形成的同時，其余雜質被晶體包裹而析出；反之養晶溫度的升高縮小了體系溫差，減緩結晶速率，純度隨之顯著提高。可以發現，豆甾醇純度在30℃時達到頂峰，但得率較之于25℃顯著下降，且25～35℃區間內純度并無顯著差異。因此，接近常溫的25℃為較合適的養晶溫度。

2.2.6 養晶時間的選擇

選取料液比1∶70、超聲時間3 min、超聲功率90 W、養晶溫度25℃，考察不同養晶時間對豆甾醇精制效果的影響，結果如圖10所示。

圖10 養晶時間對豆甾醇純度和得率的影響

由圖10可知，3 h前隨養晶時間延長，豆甾醇得率不斷提高，純度先增大后降低，但無顯著性變化,然而3 h后豆甾醇純度和得率均呈下降趨勢。這可能是由于豆甾醇晶體已完全析出，而非目標溶質附著于豆甾醇晶體表面形成的共結晶現象所致。因此，選擇3 h為豆甾醇精制的養晶時間較為合適。

根據上述單因素實驗結果，選擇丙酮為溶劑，料液比1∶70，養晶溫度25℃，養晶時間3 h，超聲時間3 min，超聲功率90 W對豆甾醇進行2次精制，豆甾醇純度達到了99.36%，其GC-MS譜圖見圖11。

圖11 豆甾醇的GC-MS譜圖

2.3 結構鑒定

2.3.1 MS(見圖12)

一般含有羥基(—OH)和氨基(—NH2)的化合物都能被三甲基硅烷化，常用符號“TMS(Trimethylsiyl)”表示。如圖12所示，豆甾醇(ST)經衍生化后，會形成其硅烷化衍生物ST-TMS。ST-TMS在質譜條件下，羥基中的氧會獲得一個質子，從而形成[ST-TMS+H]+母離子(m/z484.46)。母離子丟失一個TMS-OH后，會形成相應的[ST-TMS+H—TMS-OH]+(m/z394.41)；丟失側鏈和TMS-OH后，會形成相應的[ST-TMS+H—TMS-OH—side chain]+(m/z255.20)。圖11中，保留時間為13.88 min的物質相應的質譜圖可以找到離子m/z484.46、m/z394.41和m/z255.20，可以鑒定其對應的產物為豆甾醇。

2.3.2 FT-IR(見圖13)

經與文獻[20]對照發現，該樣品存在豆甾醇的特征吸收峰，如970 cm-1和960 cm-1，說明上述工藝所得高純度樣品為豆甾醇。

圖12 豆甾醇的MS譜圖

圖13 豆甾醇的FT-IR譜圖

2.3.3 NMR

為了進一步驗證結晶產品為豆甾醇，通過核磁共振對樣品進行了結構表征。圖14為豆甾醇的1H NMR譜圖及分子結構示意圖。

豆甾醇1H NMR(400 MW，CDCl3)圖解：1H NMR(400 MW，Chloroform-d)δ5.35(d，J=5.3 W，1H)，δ5.15(dd，J=15.1、8.6 W，1H)，δ5.02(dd，J=15.2、8.6 W，1H)，δ3.52(s，1H)，δ2.35～2.18(m，2H)，δ2.11～1.92(m，3H)，δ1.91～1.77(m，2H)，δ1.70(ddd，J=14.6、9.3、5.5 W，1H)，δ1.59～1.40(m，12H)，δ1.28～0.90(m，13H)，δ0.88～0.77(m，8H)，δ0.70(s，3H)。

豆甾醇的C6、C22、C23、C3上的氫對應的化學位移分別為5.35、5.15、5.02和3.52，質量比為1.21∶1.16∶1.08∶1.23，約為1∶1∶1∶1，且由豆甾醇1H NMR(400 MW，CDCl3)圖解可知，積分圖14所得氫原子與豆甾醇分子結構式理論氫原子數相同，并與文獻[3,21]核磁分析數據相符，符合豆甾醇結構式。

圖14 豆甾醇的1H NMR譜圖及分子結構示意圖

3 結 論

通過多級分步結晶法將豆甾醇純化分為富集和精制兩步工藝，富集工藝探究非極性溶劑的篩選、料液比、養晶溫度和養晶時間對目標物純度和得率的影響。單因素實驗確定最佳的豆甾醇富集條件為：以環己酮為結晶溶劑，料液比1∶3.5，養晶溫度25℃，養晶時間16 h。在最佳富集條件下重復結晶5次，豆甾醇的純度達到94.69%。輔以超聲輔助進一步精制豆甾醇，單因素實驗結果表明在以丙酮為精制溶劑、超聲時間3 min、超聲功率90 W、料液比1∶70、養晶溫度25℃、養晶時間3 h為結晶條件，經過2次結晶豆甾醇的純度達到99.36%，實現了高純度豆甾醇的制備，經質譜、紅外光譜和核磁等結構鑒定確認富集精制工藝制得的樣品為豆甾醇。