光譜法及分子對接技術研究黃體酮與牛血清白蛋白的結合機制

楊淑玲， 廖先萍， 范 星， 庹 潯

(1. 南昌大學 化學學院， 江西 南昌 330000； 2. 南昌大學 藥學院， 江西 南昌 330000)

1 引 言

黃體酮(Progesterone，PROG)是由卵巢黃體分泌的一種內源性類固醇激素，對雌激素激發過的子宮內膜有顯著形態學影響，可以保護女性的子宮內膜[1]。在女性懷孕期間，PROG可以降低子宮緊張度且抑制其興奮性，使孕激素所引起的子宮內膜增殖期轉為分泌期，為孕卵著床提供有利條件并維持妊娠，同時促進乳房發育，抑制排卵，支持并保障胎兒的早期生長及發育。PROG也是臨床干預先兆流產的常用藥物之一[2]，但是大劑量黃體酮會給孕婦帶來乳腺脹痛、腸道不適、偏頭痛等副作用[3]。

血清白蛋白是生物體內重要的載體蛋白，能運輸許多藥物分子到達受體部位發揮藥效，還能與內源性或外源性化合物結合起到儲存的作用[4-5]。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)的序列十分相似, 兩者之間的同源性高達76.5%，且不同氨基酸均為保守性替換[4]。BSA相較于HAS價廉易得，因此研究人員將BSA作為化學生物學中研究人類血清白蛋白性質的常用模型。利用光譜學技術特別是熒光光譜技術揭示BSA與藥物小分子之間的相互作用機制的研究工作已有廣泛報道[5-6]。隨著大量蛋白質三維精細結構的確定以及計算機模擬技術的快速發展，分子對接技術已經成為研究蛋白質與小分子之間相互作用的有效手段[6-8]。例如，王曉霞等運用該方法探究了鹽酸四環素與BSA的相互作用[9]。盡管國內外的學者對黃體酮多方面的藥理作用已經有所認識，但其中大多是關于黃體酮在先兆流產及腦神經保護等臨床應用方面的研究[3,10]，尚未關注PROG在體內的傳輸機制以及與相關蛋白質的相互作用。因此，本實驗擬整合光譜學和分子對接技術的優點在分子水平探究PROG與運輸蛋白(BSA)之間的相互作用機制，為揭示PROG對人體健康的影響提供數據參考。

2 實 驗

2．1 試劑與儀器

試劑：BSA(BIOFROXX，德國，純度≥98%)，以超純水為溶劑配制成1×10-2mol·L-1的BSA儲備液，-20 ℃冷藏備用,臨用逐級稀釋；PROG(上海源葉生物公司，純度≥99%)，用乙醇配制成1×10-2mol·L-1溶液，-20 ℃冷藏備用,臨用稀釋；Tris-HCl緩沖溶液：pH=7.4，含0.15 mol·L-1氯化鈉以調節離子強度。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

測試儀器:日立F-4500熒光光譜儀(帶溫控設備，石英比色皿)；METTLER TOLEDO pH計；布魯克TERSON-27紅外光譜儀(帶ATR附件)。

2．2 實驗方法

2．2．1 熒光光譜和同步熒光光譜

293 K時，準確移取3 mL的Tris-HCl緩沖液至1 cm的比色皿中，固定緩沖溶液中BSA濃度為3.33×10-7mol·L-1，逐漸增加PROG濃度(每次改變3.33×10-7mol·L-1)，掃描300～450 nm波長范圍內的發射光譜并記錄結果，298，303,310 K的研究與上述步驟一致。

設置熒光的波長差值Δλ分別為15 nm和60 nm，掃描同步熒光光譜并記錄結果。

2．2．2 分子對接技術研究PROG和BSA的相互作用

PROG的結構采用ChemBio3D Ultra14.0生成，并用MMFF94分子力場進行最低能量優化，將得到的構型用于分子對接操作；從RSCB數據庫中下載BSA的晶體結構(編號1H9Z)，用Chemra程序檢查該晶體結構的氨基酸殘基并使之完整；采用軟件AutoDock Vina和Pymol對PROG和BSA的三維結構進行處理并模擬兩者1 ∶1結合時的構象[6]。使用LigPlus+分析PROG和BSA之間的疏水作用力及氫鍵。

2．2．3 紅外光譜測定

按照文獻[11]的實驗方法測定BSA游離體系和PROG-BSA復合物體系的紅外光譜。儀器參數設置如下：分辨率4 cm-1，掃描背景和樣品次數64次。

3 結果與討論

3．1 PROG與BSA 相互作用的熒光光譜分析

BSA結構中的芳香族氨基酸殘基(Trp/Tyr/Phe)能夠發射一定強度的內源熒光[8,12]。當以280 nm為激發波長時，345 nm譜帶為這些氨基酸的主要熒光信號，而在該條件下PROG不發熒光。因此利用熒光光譜探究PROG對BSA熒光強度的影響可以很好地揭示兩者之間的相互作用機制。如圖1所示，隨著研究體系中PROG濃度的增加，BSA的熒光強度逐漸降低，說明PROG誘導BSA的內源熒光發生猝滅，即兩者之間存在相互作用。

[BSA]1-9= 3.33×10-7mol·L-1, [PROG]1-9=(0, 3.33, 6.66, 10, 13.33, 16.66, 20, 23.33, 26.66)×10-7mol·L-1

圖1 PROG-BSA體系的熒光光譜

Fig.1 Fluorescence spectra of PROG-BSA system

3．2 PROG與BSA結合的熱力學參數與作用力類型判斷

根據Stern-Volmer方程處理熒光光譜實驗數據，可以進一步推斷猝滅機理：

F0/F=1 +Ksv[Q]=1 +Kqτ0[Q],

(1)

在298 K時，PROG 對BSA的猝滅速率常數Kq為5.0×1012L·mol-1·s-1，比各種猝滅劑對生物大分子的最大碰撞猝滅常數2.0×1010L·mol-1·s-1高出2個數量級，由此可以判斷PROG的存在誘導BSA的熒光產生了靜態猝滅[4,13]。

根據方程(2)可以計算PROG-BSA體系在不同溫度下的結合常數Ka和結合位點數n：

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q],

(2)

由擬合直線的斜率和截距所得結果如表1所示。隨著體系溫度的上升，PROG與BSA之間的結合常數Ka逐漸降低，進一步確認PROG對BSA具有靜態猝滅作用[12,14]。此外，在人體體溫范圍(36～37 ℃)內PROG與BSA的結合常數達到104級別，說明其進入人體后與血液中的白蛋白具有較強的相互作用[14]，從而被白蛋白運輸到靶器官。通過分析藥物與蛋白質大分子反應前后兩者熱力學熵變ΔS和焓變ΔH的相對大小即可判斷復合物的作用力類型[14-16]。若ΔH<0、ΔS<0，主要表現為范德華力和氫鍵；ΔH<0、ΔS﹥0，主要表現為靜電作用力；ΔH﹥0、ΔS﹥0，主要表現為疏水作用力。根據表1可知，ΔG<0，ΔH<0、ΔS<0，說明反應可以自發進行，且PROG和BSA之間的作用力為范德華力和氫鍵。

表1 不同溫度下PROG-BSA體系的熱力學常數

3．3 PROG與BSA的結合位點的確定

從表1可知，PROG和BSA之間存在1個結合位點。BSA有兩個與小分子藥物結合的結合位點，分別位于結構域ⅡA(結合位點Ⅰ)和ⅢA(結合位點Ⅱ)內[14,17]。位點Ⅰ中含有兩個能夠產生熒光的氨基酸(Trp和Tyr)，而位點Ⅱ只含有Tyr殘基。激發波長為280 nm時，可同時激發Trp和Tyr熒光，而激發波長為295 nm僅能激發Tyr的熒光[18]。因此，對比不同激發波長時PROG對BSA的熒光猝滅程度，可確定復合物體系的結合位點。如圖2所示，熒光光譜結果表明，激發波長為280 nm時，PROG對BSA的熒光猝滅程度明顯大于295 nm時PROG對BSA的熒光猝滅程度，即Trp殘基和Tyr殘基均參與了猝滅過程，說明PROG和BSA的結合位點為位點Ⅰ[19]。

圖2 不同濃度PROG下BSA的熒光光譜

Fig.2 Fluorescence spectra of BSA at different concentrations of PROG

[BSA]=3.33×10-7mol·L-1, [PROG]1-5=(0, 3.33, 6.66, 10, 13.33)×10-7mol·L-1

圖3 PROG-BSA體系的同步熒光光譜。(a)λ=15 nm; (b)λ=60 nm。

Fig.3 Synchronized fluorescence spectra of PROG-BSA system. (a)λ=15 nm. (b)λ=60 nm.

3．4 PROG對BSA構象的影響

[BSA]=[PROG]=3.33×10-7 mol·L-1

Fig.4 FT-IR spectroscopy of BSA and PROG-BSA system

表2 加入PROG前后BSA二級結構構象的百分含量

Tab.2 Percentage of each conformation in BSA before and after addition of PROG

體系α-螺旋/%β-折疊/%β-轉角/%β-片層/%BSAPROG-BSA64.0760.6811.6626.0019.4011.994.871.33

當PROG與BSA的物質的量比為1∶1時，α-螺旋含量由64.07%降低到60.68%，即PRORG的存在會誘導BSA α-螺旋構象減少。紅外光譜和同步熒光的結果相互印證，都表明PROG會使BSA的構象發生變化。

3．5 PROG和BSA結合能量轉移

根據F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移定理，當小分子藥物與蛋白質之間滿足最大距離在7 nm范圍內，將會發生非輻射能量轉移[13,21]。如圖5所示，PROG和BSA之間存在非輻射能量轉移的可能性。將光譜重疊部分采用矩形分割法求出PROG和BSA濃度比為1 ∶1時，兩者積分值J=6.87×10-17cm·L·mol-1、R0=1.07 nm、r0=1.63 nm。PROG和BSA反應的結合距離小于7 nm，滿足非輻射能量轉移條件，即PROG和BSA之間存在非輻射能量轉移，導致BSA熒光猝滅。

[BSA]=[PROG] =3.33×10-6 mol·L-1

Fig.5 Overlapping of fluorescence spectrum of BSA(a) and ultraviolet absorption of PROG(b)

3．6 分子對接

分子模擬可以在理論上對生物大分子和活性小分子之間作用的模式進行合理預測[13,16-17]。本研究使用AutoDock Vina對PROG和BSA的兩個結合位點的結合情況進行模擬分析。模擬結果表明PROG進入BSA結合位點Ⅰ的吉布斯自由能ΔGⅠ=-36.425 kJ，進入位點Ⅱ的吉布斯自由能ΔGⅡ=-34.332 kJ。根據相關熱力學理論，可以推測當PROG和BSA結合時，PROG更傾向于進入BSA的結合位點Ⅰ內結合，模擬結果與位點實驗結果一致。

圖6顯示了PROG進入到BSA中的疏水空腔I時兩者形成復合物的三維構象。通過LigPlus+軟件進一步分析發現PROG與Trp214、Lys199、Lys195、Ala291等氨基酸殘基之間存在相互作用。除此之外，PROG還與Lys195殘基之間存在鍵長為0.288 nm的氫鍵。Trp214是BSA的主要發光基團，由此可知PROG與Trp214的相互作用是引起BSA熒光猝滅的主要原因，該結果與熒光光譜實驗結果一致。

圖6 PROG與BSA在結合位點Ⅰ的分子對接模擬圖。(a)AutoDock Vina軟件分析結果；(b)Ligplus+軟件分析結果。

Fig.6 Molecular docking model of PROG and BSA. (a)Analysis results by AutoDock Vina. (b) Analysis results by Ligplus+.

4 結 論

通過整合多種光譜學和分子模擬技術方法對PROG與BSA的結合機制進行了詳細研究。結果表明，PROG能夠自發與BSA形成穩定的二元復合物。熒光光譜和分子對接結果互相印證，都表明PROG與Trp214之間的相互作用是導致BSA熒光猝滅的主要原因。紅外光譜結果顯示PROG誘導BSA的二級結構發生改變。在正常人體體溫條件下，PROG與BSA的結合常數達到104級別，說明兩者之間具有較強的相互作用。該研究結果為進一步探究黃體酮在生物體內的作用機制提供了一定的參考數據。