熒光碳量子點測定替硝唑的應用研究

姬 碩，劉曉莉，陳田田，張 蒙，朱慧敏

(延安大學化學與化工學院，延安市分析技術與檢測重點實驗室，陜西 延安 716000)

替硝唑(Tinidazole，TNZ)是第二代硝基咪唑類藥物，與甲硝唑相比，具有抗炎效果更好，毒性低，生理活性強、耐受性更好等特點[1]。目前，替硝唑含量的測定主要有高效液相色譜法[2]、反相高效液相色譜法[3]、分光光度法[4]等，熒光分析法對其含量測定的報道較少。熒光碳量子點(CQDs)是一種具有低毒性，強熒光的球形結構的碳納米顆粒，其尺寸一般小于10nm。近年來，已經有越來越多的學者致力于碳量子點的性質及其相關應用研究。

本文參考菜花碳量子點[5]的合成方法，利用該碳量子點作為熒光物質，提出了基于碳量子點熒光猝滅法檢測替硝唑的新方法，并研究了其猝滅機理。該方法快速、便捷，可用于樣品中替硝唑含量的測定。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

F-4500型熒光光度計(日本日立公司)；8453型紫外-可見分光光度計(美國安捷倫公司) ；FLSP920型瞬態穩態熒光光譜儀(英國愛丁堡公司)。

TNZ標準溶液：1.0×10-3mol/L，稱取TNZ標準品0.0247g(中國藥品生物制品檢定所)，用UP水溶解并定容(100mL)，4℃冰箱保存待用，使用時逐級稀釋。PBS緩沖液(pH值=7.10)；所用試劑均為AR純，水為UP超純水。

1.2 實驗原理

替硝唑可以對菜花碳量子點熒光產生明顯的猝滅作用，在pH值=7.10的PBS緩沖溶液中，碳量子點的熒光猝滅程度與替硝唑濃度相關。

1.3 實驗方法

1.3.1 菜花碳量子點的制備

稱取菜花粉末8g于水熱反應釜(聚四氟乙烯內膽)中，并量取水30mL，將反應釜置于200 ℃干燥箱，保溫22h。經文獻方法[5]純化并且干燥后，配制成0.25 g /L 的溶液，4℃保存待用。

1.3.2 TNZ測定

將2.00mLCQDs溶液、3.00mL PBS緩沖溶液、以及適量TNZ溶液依次加入到10mL玻璃比色管中，用UP水稀釋至刻度，搖勻。反應30min后(室溫)，測定其熒光強度(F)及試劑空白熒光強度(F0)，λex/λem=336nm/422nm，狹縫寬度均為5nm。

2 結果與討論

2.1 熒光發射譜圖

室溫下，固定激發波長λex =336nm，掃描CQDs-TNZ體系的熒光光譜圖，其發射譜圖如圖1所示。據圖可知，加入TNZ后，CQDs的熒光強度明顯降低，且隨著TNZ的濃度增加，體系熒光強度的變化值同一定范圍的TNZ濃度成正比。

圖1 CQDs-TNZ體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of CQDs -TNZ system

2.2 反應條件的優化

按照實驗方法試驗了碳量子點用量、緩沖溶液種類及用量、反應時間、試劑加入順序等對CQDs-TNZ體系熒光強度降低值的影響，試驗表明，該試驗體系的最佳試劑用量為2.00mL的CQDs溶液、3.00mL pH值=7.10的PBS緩沖溶液，當室溫下放置30min后，體系的ΔF值最大，且在4h內保持穩定，試劑加入順序對試驗體系無影響。

2.3 表面活性劑和β-環糊精的影響

表面活性劑通常會對體系產生增敏作用，用SDBS、吐溫-80、CPB、SDS、CTMAB等表面活性劑以及β-CD對體系猝滅程度的影響進行試驗。研究結果表明，吐溫-80對體系ΔF值產生增敏作用。對其用量進行了研究，最佳用量為0.5mL。

2.4 共存物質干擾

在優化好的試驗條件下(相對誤差不得大于±5%)，當TNZ濃度為1.0×10-5mol/L時， 1000倍的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉，100倍的Al3+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+，10倍的Pb2+,同倍的Fe3+、Ag+不干擾測定。

2.5 線性方程和檢出限

在優化好的實驗條件下，當TNZ濃度在8.0×10-7～2.0×10-7mol/L之間時，熒光強度的猝滅值與TNZ的濃度線性關系良好，線性回歸方程為ΔF=1.846×107c(mol/L)+30.84，r=0.9992。平行測定濃度為1.0×10-5mol/L的TNZ溶液5次，其RSD為0.15%，該體系測定TNZ的方法檢出限為2.3×10-7mol/L。

圖2 CQDs-TNZ體系的標準曲線Fig.2 The graph of the linear eaquationof the system of CQDs-TNZ

2.5 回收率測定

隨機抽取替硝唑片10片(同一廠家、同一批次)，分析天平稱取其準確質量，研磨后稱取適量粉末(約為0.0247gTNZ)用UP水溶解并定溶于100mL棕色容量瓶中，超聲。冰箱冷藏靜置10h后，過濾。準確移取適量過濾液，按照實驗方法測定實際藥品中TNZ含量，并且進行回收率測定(表1)。

表1 實際藥品測定及回收率實驗(n=5)Tab.1 Determination of TNZ in practical drugs and recovery of the method(n=5)

1-山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司公司，產品批號：160101；2-山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司公司，產品批號：160501。

2.3 猝滅機理探究

圖3 紫外-可見吸收光譜Fig.3 The ultraviolet-visible absorption spectrum

CQDs、TNZ以及CQDs-TNZ體系的紫外-可見吸收光譜如圖3所示，CQDs的紫外吸收峰在272nm處，TNZ的吸收峰在317nm處；將TNZ加入到CQDs溶液中后，發現CQDs-TNZ體系的吸光度值變大，但是其最大吸收長的位置并未改變，經對比發現，CQDs和TNZ二者吸收曲線疊加后與CQDs-TNZ體系的吸收曲線重合，由此可說明替硝TNZ和CQDs之間并沒有新的物質生成，TNZ對CQDs的熒光猝滅機理為動態猝滅。

單一的動態猝滅或者靜態猝滅均遵循Stern-Volmer方程：F0/F=1+Kqτ0[Q] = 1 + KSV[Q],其中[Q]為猝滅劑濃度。依據Stern-Volmer方程，對F0/F和[Q]進行線性回歸，所得直線斜率為KSV，如果KSV隨溫度的升高而減小,則為靜態猝滅，反之則為動態猝滅。所得如表2所示，隨著溫度由20℃升至40℃，KSV增大，所以替硝唑對碳量子點是以動態猝滅方式作用的。

表2 不同溫度下替硝唑與碳量子點的猝滅常數Tab.e 2 The quenching constants of CQDs by TNZ at different temperatures

通過瞬態穩態熒光光譜儀分別測定CQDs和CQDs-TNZ體系的熒光壽命， CQDs和CQDs-TNZ體系的熒光壽命分別為6.47ns和 5.62ns，熒光壽命減小，說明替硝唑對碳量子點的猝滅機理是動態猝滅。

3 結論

利用替硝唑對熒光碳量子點的猝滅作用，通過試驗，確定了最佳的試驗條件，建立了線性方程，并且通過探討紫外-可見吸收光譜的變化，熒光壽命的減小以及猝滅常數受溫度的影響，可以確定替硝唑對該碳量子點的猝滅機理為動態猝滅，據此提出了碳量子點測定替硝唑的熒光新方法。